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Intitulé du Master 

: Biochimie Appliquée
Semestre : S1
Intitulé de l’UE : UED11: Découverte (Obligatoire)
Intitulé de la matière : UED111 : Analyses Biochimiques Médicales ANBM-MB17
Crédits : 2

Analyses biochimiques médicales

1
Introduction

Définition de la biochimie médicale,


Branche de la biologie médicale dont le sujet est
généralement l'analyse des molécules se trouvant
dans les différents fluides corporels. Analyser ces
molécules permet ultérieurement de pouvoir poser
des diagnostics.

2
La chimie des urines puis du sang et des tumeurs a été
pendant longtemps la seule discipline de la « biologie
médicale ».
L'hématologie, l’histologie, la microbiologie,
l'immunologie se sont ensuite fortement développées et
se regroupent souvent maintenant au côté de la
biochimie, dans le cadre moderne de la biologie
moléculaire.
La biochimie clinique associe la chimie physiologique,
la chimie séméiologique et la biologie moléculaire.
3
Éléments d'organisation
du laboratoire
• L'examen biologique n'est pas seulement une analyse, mais
représente un ensemble complexe d'étapes qui, du
prélèvement au compte rendu final, nécessite une surveillance
permanente. Les résultats devront en effet être aussi exacts que
les techniques modernes le permettent.

• Cette « production » de résultats est issue de trois étapes


successives :
(a) La première, préanalytique, s'effectue d'abord au contact du
patient et correspond au prélèvement ; elle se continue par le
transport et la réception du prélèvement par le laboratoire.

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(b) La deuxième, analytique, est l'étape technique proprement
dite avec tous les éléments du traitement de l'échantillon.
(c) La troisième étape, post-analytique, consiste à valider les
résultats bruts, à les analyser dans leur cohérence et à les
présenter dans une forme permettant une bonne interprétation
par le prescripteur.

Chaque étape de ce processus analytique est l'objet de contrôles


qui contribuent à une assurance de qualité.

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A. Prélèvement
La procédure de recueil du prélèvement devra tenir compte de
trois types de paramètres
Sujet Etat physiologique •Age, sexe, taille, poids
•Jeune , stresse, activité
physique, régime, tabac
•Grossesse lactation,
ménopause
Position • debout
•couché
Rythme • circadien
• hebdomadaire
• mensuel
constituant Métabolisme in vitro,
dégradation
Sensibilité aux agents • lumière,
extérieurs •Variation de température
effecteurs • analogues structuraux
• médicaments
Spécimen Plasma/ sérum
Urine 6
Liquide céphalorachidien
• Paramètres liés au sujet
Si un jeûne de 12 heures est impératif pour un bilan lipidique,
la glycémie et la phosphatémie, un jeûne de 3 heures est
suffisant pour la majorité des autres paramètres.

• Paramètres liés au constituant dosé


II faut éviter une dégradation du constituant à doser soit en
utilisant un agent conservateur, soit en respectant la chaîne
du froid.

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• Paramètres liés au spécimen
Ils varient avec la nature du spécimen et du lieu de ponction
Exemples d'utilisation des tubes en biochimie (les couleurs sont
celles
de la société « Becton Dickinson ».
• Tube héparine (bouchon vert) lonogramme. Ammonium,
Cortisol
• Tube fluoré (bouchon gris) Glucose, Lactate
• Tube sec avec gel séparateur Enzymes, Médicaments,
lonogramme. Substrats (bouchon rouge marbré)
• Tube EDTA (bouchon violet) Hémoglobine glyquée. Bilan
lipidique

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• A-1. La durée de conservation doit être réduite au maximum.
Après décantation, les temps de conservation sont variables
en fonction de la durée et de la température de conservation

CONSERVATION DES SUBSTRATS


Sériques ou plasmidiques
Substrat +4°C 20-25°C -20°C
Bilirubine * oui oui oui ±
Cholestérol < 6 jours < 6 jours au moins 6 mois
Créatinine 24 h 24 h au moins 6 mois
Fer < 7 jours < 4 jours ?
Albumine < 6 jours < 6 jours au moins 6 mois
Glucose < 7 jours <24h +
Urates 5 jours 5 jours au moins 6 mois
Urée < 3 jours <24h au moins 6 mois
Triglycérides < 3 jours non -
Phosphates < 7 jours < 2 jours -
* A la condition que le tube soit toujours conservé à l'abri de la lumière
(pigment).
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CONSERVATION DES ENZYMES (en tube fermé)
Délai pendant lequel la perte d'activité des enzymes est < à 10 %
Enzymes +4°C 20-25 °C -20°C
Aldolase < 5 jours < 3 jours -
a-amylase < 5 jours < 5 jours -
Cholinestérase < 7 jours < 7 jours 1 semaine
CK (NAC activée) < 7 jours < 2 jours 1 mois
CK-MB (NAC) <24h <lh -
TGO (ASAT) < 3 jours < 3 jours 1 mois
TGP (ALAT) < 3 jours < 3 jours non, instable
•yGT 7 jours 7 jours 1 mois
LDH 3 jours 3 jours instable
Lipase 5 jours 24 h -
Phosphatases < 7 jours < 2-3 jours 1 mois
alcalines

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• A-2. Traitement du prélèvement
Pour chaque analyse, il existe une procédure analytique bien
définie, associant les éléments suivants, réunis dans un
manuel interne au laboratoire :
-Logistique: localisation, nom du responsable (numéro de
téléphone), disponibilité, délai de réponse, possibilité de
réponse en urgence, cotation.

- Spécimen : nature, volume, type de tube, identification,


étiquetage, prétraitement éventuel du prélèvement,
conditions de stabilité, conditions de transport en cas de
sous-traitance.

- Facteurs de variations biologiques (à prendre en compte pour


le prélèvement), renseignements cliniques indispensables.
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- Principe de dosage.

- Matériels - méthodes

- Mode opératoire
préparation des spécimens, des réactifs, des calibrateurs,
conditions opératoires du dosage (programmation des
instruments, température, rapport de dilution, durée et
nombre de mesures, nature du blanc réactif, mode,
fréquence et contrôle du calibrage...), calculs (mode
d'expression, conversions du système SI versus système
conventionnel).

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- Performances analytiques : domaine de mesure (limite de
détection, limites de linéarité), précision pour différents
niveaux de concentration (dans la série, de série à série),
exactitude, interférences (endogènes : bilirubine, trouble,
hémolyse-exogènes : médicaments).

- Valeurs usuelles : en fonction de l'âge, du sexe, des conditions


physiologiques.

- Précautions - causes d'erreur


- Références bibliographiques

- Cahier de bord : changement de lot de calibrateur,


changements de lot de réactifs.
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B. Résultat — Interprétation
B-1. Erreurs analytiques
Elles sont de deux types.
B.1.1. Erreurs aléatoires
Elles affectent la PRECISION du processus analytique.
• La précision est : l'accord, la similitude entre des mesures
répétées sur un même échantillon.
• L'imprécision caractérise la dispersion des valeurs obtenues
lors des mesures répétées de ce même échantillon.
L'imprécision peut être quantifiée par l'ÉCART-TYPE ou par le
COEFFICIENT de VARIATION

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• Lorsque l'imprécision est calculée sur des mesures répétées
dans les mêmes conditions (même série, sans réétalonnage),
on utilise le terme de RÉPÉTABILITÉ.

• Le terme de REPRODUCTIBILITÉ correspond à des mesures


répétées dans des conditions différentes (jour à jour,
laboratoire à laboratoire, technicien à technicien...)..

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• Les erreurs aléatoires affectent tous les échantillons en plus
ou en moins, avec une amplitude variable d'un échantillon à
l'autre. On peut distinguer :

- les erreurs aléatoires relatives : l'amplitude maximale de


l'erreur est fonction de l'analyse.
• Exemples :
- incertitude sur la mesure des volumes de l'échantillon ou du
réactif ;
- instabilité du système photométrique ;
- instabilité du système de thermostatisation...

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- les erreurs aléatoires « constantes » : l'amplitude maximale de
l'erreur est constante quelle que soit l'analyse.
Exemple : incertitude sur la détermination du point d'équivalence
lors de mesures titrimétriques.

B.1-2. Erreurs systématiques

Elles affectent l'EXACTITUDE du processus analytique.


L'exactitude est l'accord entre la meilleure valeur estimée de la
quantité mesurée et la valeur vraie.
- La meilleure valeur estimée peut être la moyenne des résultats
de mesures repétées.
- La valeur vraie est la valeur obtenue avec une technique de
référence.
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En présence d'erreurs systématiques, tous les résultats sont
affectés d'un biais dans le même sens. On peut aussi, pour ce
type d'erreur, différencier :
- les erreurs systématiques relatives : le biais est fonction de
l'analyse effectuée et dépend de diverses variables.
Exemples :
- erreur sur la concentration de l'étalon ;
- erreur sur les mesures de volume (réactif ou échantillon) pour
les techniques utilisant un coefficient et non un étalon :
- décalage de la longueur d'onde du spectrophotomètre ou
thermostatisation inexacte pour les mesures d'activités
enzymatiques.
- Récupération imparfaite lors d'extraction

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• - les erreurs systématiques « constantes » : le biais est
indépendant de l'analyse en cause. Exemples :
- existence d'un trouble non compensé par la soustraction d'un
blanc sérum ou d'un blanc réactif ;

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B.2. Mode d'expression des résultats
• Une très grande rigueur doit être utilisée pour exprimer ces
résultats.

• La valeur numérique doit comporter au maximum deux


chiffres après la virgule.

• Les unités et leurs sous-multiples résultent de cette règle.


• De même, un résultat ne doit pas comporter plus de trois
chiffres, dans le cas contraire le multiple supérieur de l'unité
doit être utilisé.

20
Les techniques analytiques de
laboratoire médical relevant de la
science transfusionnelle

21
Haematologie
1. Les types de cellules sanguines
- Erythrocytes : 4–5.1012 / litre (4–5 . 106 par mm3) de sang.
- Leucocytes : 8 . 109 par litre (8000 par mm3) de sang.
- Thrombocytes (plaquettes): 150–300 . 109 par litre (150000–
300000 par mm3).

22
• Coagulation du sang
5–10 minutes
- Le sérum : liquide jaune
- Le cailloux: masse rouge
La présence d’un anticoagulant dans le tube prévient la
coagulation, après centrifugation on obtient
- Le plasma: liquide jaune
- Le culot: les cellules du sang

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• La différence entre le plasma et le sérum
- Le plasma contient la protéine fibrinogène et d’autres
protéines
- Le sérum ne contient pas de fibrinogène mais les autres
protéines sont présentes. Le fibrinogène se transforme en
fibrine insoluble, qui avec les erythrocyt.es forme le cailloux

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2. Collection des spécimens de sang
• Principe:
Le sang veineux et collecté à partir de la veine d’un bras à l aide
une aiguille et seringue
Le sang capillaire est collecté à partir du doit, de l’oreil ou du
talon (pour l’enfant).

• Matériel et réactifs
Pour désinfecter la peau: Coton + 70% éthanol
Gants, garrot, aiguilles
Tubes ou flacons

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26
• 3. Estimation de la fraction volumique des érythrocytes
fraction volumique des érythrocytes
= volume total des érythrocytes/volume total du sang
Test pour les personnes soufrant d’anémie

La microméthode
• Principe
Le sang (+ anticoagulant) est placé dans un tube capillaire long
puis centrifugé. Le volume atteins par les érythrocytes est lu
par un lecteur à échelle.

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• Technique de mesure
- Les tubes capillaires sont remplie à ¾
- Le tube est scellé à l’une des extrémité avec la cire
- Le tube est placé dans une centrifugeuse Microhaematocrit
- Centrifugation à 3000g/10min
- Lecture du volume

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• La macrométhode
Le sang est collecté dans des tubes gradué Wintrobe (contenant
EDTA), puis centrifugé. Le volume des érythyrocytes est lu
directement à partir du tube.
Le tube Wintrobe est de 9.5 cm x 0.6cm gradué de 0 à 100.

La technique
- Le tube est centrifugé à 2300g/30min
- Lecture du volume des érythrocyte (il donne le pourcentage
donc on divise par 100)

29
Le système AB0

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• Les Antigènes A et B sont des sucres présents
partout dans la nature.

• Les bactéries du tube digestif sécrètent en


permanence ces sucres A et B.

• Passage sanguin

• Stimulation permanente de la fabrication


d’anticorps anti A ou anti B en fonction des
antigènes A et/ou B portés sur toutes les cellules
cellules

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Pour un groupe donné :
Agglutinines présentes dans le plasma
dirigées contre les agglutinogènes absents
des hématies

Exemple : Sang Groupe A

Agglutinogènes A sur les hématies


Agglutinines anti B dans le plasma

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Génotyp
Groupe Antigène Anticorps Fréquence
e

A/A
A A Anti B 45%
A/O

B/B
B B Anti A 9%
B/O

AB A, B - A/B 3%

O - Anti A+Anti B O/O 43%

33
34
Des Antigènes à la surface des hématies :

les agglutinogènes

Des Anticorps dans le plasma :

les agglutinines

Les agglutinines sont donc des anticorps naturels et


innés contre les antigènes des groupes sanguins.

Mais l’organisme peut également fabriquer des


anticorps immuns contre les antigènes des groupes
sanguins !
35
suite à un contact avec un groupe sanguin
incompatible (transfusion, grossesse) le corps
fabrique des anticorps appelés: Les hémolysines

Plus petits,
plus puissants,
hémolysent les hématies au lieu de les agglutiner,
dangereux si présents chez un donneur

Lorsque l’organisme fabrique des hémolysines


suite à un contact avec un groupe sanguin
incompatible (transfusion, grossesse) on parle
d’allo-immunisation

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• Epreuve globulaire (Beth-Vincent)

• Question : quel est l'antigène?

• Méthode : Sérums-tests : anti A, anti B

• Epreuve sérique (Simonin)

• Question : quel est l'anticorps?

• Méthode : Hématies tests : A, B

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38
39
Test de Beth-Vincent Test de Simonin

Patient 1

Patient 2

Patient 3

Patient 4

40
GROUPE SANGUIN VALIDE

ATTENTION :

Un groupage sanguin n’est considéré comme


valable

• qu’après la réalisation d’une 2eme


détermination, réalisée sur un 2eme échantillon

• prélevé à distance (notion de temps) du


précédent et si possible par un 2eme préleveur
différent.
41
ABO et transfusion

• En théorie, 2 risques
– Anticorps du receveur contre antigène du
donneur
– Anticorps du donneur contre antigène du
receveur

• En pratique, 1 risque:
– L'antigène du donneur ne doit pas rencontrer
l'anticorps du receveur

42
ABO et transfusion
Règle de base : les agglutinines (anticorps) du
receveur ne doivent pas reconnaître les
agglutinogènes (antigènes) du donneur

Exemple : Groupe A Groupe B Aglutination !!!

Les agglutinines du donneur peuvent reconnaître les


agglutinogènes du receveur!

Exemple : Groupe O Groupe A

Sans gravité : incompatibilité mineure


Volume de sang transfusé faible agglutinines du
donneur très diluées dans le sang du receveur donc
peu 43
Cas particulier : sang du donneur riche en hémolysines

Donneur (généralement du groupe O) ayant déjà subi


une première sensibilisation : erreur de transfusion
ou grossesse

Synthèse d’ hémolysines anti A ou anti B

Risque d’hémolyse grave des hématies du receveur

(Hémolysines beaucoup plus actives que les


agglutinines)

Recherche obligatoire d’ hémolysines chez les


donneurs (RIA: Recherche d’anticorps Irrégulier)
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REGLES TRANSFUSIONNELLES du SYSTEME ABO

Plasma résiduel en très faible quantité

O AB

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Système Rhésus
• 2ème système de groupe érythrocytaire

• Grande complexité (45 antigènes)


• Caractéristiques
• Les antigènes sont des protéines présentes
uniquement sur les GR humains
• Pas d'anticorps naturels réguliers
• L'antigène D définit par sa présence le
phénotype Rh+
• 4 autres antigènes principaux : C c E e
46
Système Rhésus

Génotype
Phénotype Fréquence
Allèle 1 Allèle 2

D D D+
Rhésus positif
~ 85%
D d D+

Rhésus négatif
d d D-
~ 15%

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Système Rhésus
Génotype
Fréquence
Phénotype le +
en France
probable
D+ C+ E- c+ e+ DCe/dce 34%

D+ C+ E- c- e+ DCe/DCe 20%
Rhésus
D+ C+ E+ c+ e+ DCe/DcE 13% positifs
~ 85%
D+ C- E+ c+ e+ DcE/dce 12%

Autres D+ - 6%

D- C- E- c+ e+ dce/dce 15% Rhésus


négatifs
Autres D- - < 1% ~ 15%

48
Système Rhésus
• Applications

– Transfusion:
– D-  D+
– D+  D+

– D+  D-
» 1ère transfusion: pas de problème
» Csq: immunisation anti-D du receveur
» Transfusions suivantes:
D- pas de problème
D+ Risque d'accident hémolytique
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Système Rhésus
• Applications

– Transfusion:
» Pour C,E,c,e la meme chose que pour D

» Cependant bien moins immunogène que le D

» Respect si possible des Antigènes négatifs pour


tous les sujets de moins de 70 ans et en
particulier pour les sujets féminins jusqu’à la
ménopause

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Système Kell

– Plus de 20 Antigènes connus

– Un seul important : K ou Kell1

– Transfusion : meme chose que pour


C,E,c,e

Remarque : Le phénotype standard ou Rh kell


= 5 antigènes en plus du D : C,E,c,e,K

51
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Anticorps : spécifiques mais irréguliers : non naturels
mais produits seulement après une immunisation :

-Transfusion non iso-rhésus

-Grossesse femme Rh- enfant Rh+

Donc : Individu Rh- pas d’anticorps anti Rh dans le


plasma

Mais : Si transfusion ou grossesse + synthèse d’ anti D


2 ème Transfusion ou grossesse Hémolyse !!!

Ne jamais transfuser du sang Rh+ à un receveur Rh-

Groupage : sérum test anti D


53
Appliquer les techniques
analytiques relevant de
l’histologie

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• Prélèvements
• Les prélèvements, quels qu'ils soient doivent être effectués
avec le plus grand soin, car leur qualité conditionne
directement les possibilités d'étude.
– les frottis : prélèvement médical au moyen d'un écouvillon
stérile, d'une petite brosse ou d'une petite spatule (par
exemple au niveau du col de l'utérus) ;
– les biopsies : prélèvement de très petite taille d'un tissu, à
des fins d'étude microscopique ;
– les résections d'organes en intégralité, suivies de leur
étude (dans le cas d'une tumeur, déterminer le caractère
bénin ou malin par exemple) ;
– les ponctions de liquides (pleurale, péricardique, etc.)

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• Conservation
• La congélation, utilisée pour les prélèvements en salle
d'opération dont le diagnostic doit être connu rapidement
(examen extemporané);

• La fixation par un produit chimique comme le formol , qui a


pour effet de polymériser les protéines et, dans certains cas,
les lipides présents dans l'organe. Cette technique est utilisée
pour les coupes histologiques "longues durées" après
inclusion en paraffine.

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• Amincissements

Conservation Inclusion Épaisseur de la coupe

Congélation (à -20 °C) OCT 5 à 100 μm

Polymérisation des
Paraffine 5 μm
protéines

Polymérisation des
Résine 1 à 0,05 μm
protéines et lipides

OCT: Optimal Cutting Temperature compound

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• Les coupes histologiques
Une coupe histologique est une tranche d'un organe
suffisamment fine pour pouvoir être observée au microscope.

Elles sont réalisées par un microtome pour des coupes de


quelques µm d'épaisseur ou par un ultramicrotome pour des
coupes d'environ 0,1 µm.

Les tissus sont inclus dans des résines époxy ou dans de la 


paraffine. Elles peuvent être réalisées sans inclusion préalable,
et sont alors gelées et réalisées par un cryomicrotome.

58
Microtome
Un microtome est un appareil utilisé pour l'étude (par 
coupe histologique) des cellules. Il permet de créer de fines
tranches d'un tissu étudié après fixation (souvent) ou
congélation (Allant de 2 µm à 25µm).

59
• Le microtome moderne est construit de
manière à produire de fines tranches de
matière, un peu comme le fait une machine à
couper le jambon opérant un mouvement
vertical alternatif supportant le bloc à couper
et équipé d'un rasoir prismatique fixe affûté
par pâtes diamantées sur plaque de verre.

60
• Un ultramicrotome est un appareil de très grande précision
qui permet des coupes de 80 à 100 nm servant en 
microscopie électronique.

• Son fonctionnement est similaire au microtome


• les opérations se font sous le contrôle d'une loupe binoculaire
. Les coupes sont recueillies par flottaison sur de l'eau puis
transférées sur grilles et non sur lames avant d'être colorées.

61
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63
64
• Coloration
Les tissus biologiques présentent en eux-mêmes très peu de
contraste, aussi bien en microscopie optique
 qu’en microscopie électronique. La coloration est utilisée
aussi bien pour augmenter le contraste que pour mettre en
valeur l’une ou l’autre structure en particulier.

(a) Histochimie

réactions chimiques entre le colorant (réactifs de laboratoire) et


des composants des tissus étudiés

65
• Par exemple lors d’une coloration à l’hématoxiline-éosine

 l’hématoxiline (base): colore les noyaux cellulaires en se fixant


préférentiellement aux acides nucléiques.

l’éosine (acide) se fixe préférentiellement aux molécules


basiques et permet donc de colorer le cytoplasme cellulaire

66
• Histochimie enzymatique
La distribution tissulaire de certaines enzymes spécifiques peut-
être étudiée sur des coupes fraîches en y ajoutant
un substrat spécifique de cet enzyme.

Congélation réaction enzymatique coloration du


produit

67
Historadiographie
Marqueurs radioactifs
Le marquage peut être révélé par visualisation sur microscope à
fond noir des grains d’argents formés par réaction du
rayonnement radioactif sur une plaque photographique.

Immunohistochimie
Des anticorps spécifiques sont utilisés pour venir se fixer à une
molécule de la coupe histologique.
Anticorps fluoréscents

68
• Coloration en Microscopie électronique

• Métallisation : utilisation de métaux lourds comme le plomb,


l'uranium ou le tungstène pour disperser les électrons
d'imagerie et donc donner du contraste entre différentes
structures

• Généralement les fines tranches sont colorées pendant


plusieurs minutes avec une solution aqueuse alcoolisée
d'acétate d'uranyle, puis de citrate de plomb aqueux.

69
Techniques Analytiques relevant de la
Biochimie

70
• Méthodes de dosage des protéines
• Méthodes de dosage des glucides
• Méthodes de dosage des lipides

71
Protéines plasmatiques
Les protéines représentent la plus grande partie des
matières solides du plasma. En dehors du
fibrinogène, protéine fibreuse, ce sont toutes des
protéines globulaires.

Seule la sérum-albumine est une holoprotéine, toutes


les autres étant des hétéroprotéines pouvant
contenir des lipides (lipoprotéines), des métaux
(métalloprotéines) et surtout des glucides, la plupart
des protéines plasmatiques sont en effet des
glycoprotéines.
72
Elles ont différentes fonctions:
transporteurs, anticorps, enzymes, agents
de pression oncotique, marqueurs de l'inflammation,
marqueurs tumoraux, agents de la coagulation,
facteurs de croissance

mais il faudra différencier les protéines toujours


présentes dans le plasma, éléments constitutifs de
celui-ci et celles, d'origine cellulaire, n'y apparaissant
que transitoirement.

73
• Analyses
L'exploration des protéines plasmatiques est réalisée
par le dosage individuel de telle ou telle protéine,
par le regroupement de quelques dosages, sous le
terme de profil protéique, par l'électrophorèse qui
peut être faite sur des supports différents et enfin
par l'étude éventuelle d'une protéinurie.

74
• Dosages protéiques
Ils concernent, soit la protéinémie totale, soit des dosages
individuels de protéines plasmatiques.
Protidémie totale
• Le dosage des protéines ou protides totaux est extrêmement
classique.
• Il est effectué par la traditionnelle réaction du biuret, plus ou
moins modifiée.

75
• La réaction du biuret est une réaction mettant en
évidence les liaisons peptidiques.
• La méthode consiste à mettre en milieu basique des
ions cuivre(II) en présence de protéines (ou
de biuret). Un complexe coloré mauve ou violet se
forme en effet lorsque les ions Cu2+ sont complexés à
3 ou 4 atomes de nitrogène des liaisons peptidiques
de la protéine. Plus nombreuses sont les liaisons,
plus grande est l'absorbance.
•  biuret ((H2N-CO-)2NH).
• l‘absorbance est mesurée à 565nm

76
Deux modification majeures du test du buret.
• L’essai de Lowry
• L’essai acide bicinchoninique
Dans ces tests, le Cu+ formé durant la réaction biuret réagis avec
d’autres réactifs conduisant à l’intensification de la couleur.

• Dans l’essai de Lowry, le Cu+ du complexe protéine-Cu+ est


réoxydé en Cu2+ par MoVI dans le réactif de Folin-Ciocalteu et
qui forme le molybdenum bleu (MoIV).

• Dans l’essai acide bicinchoninique, le Cu+ forme un complexe


violet avec l’ acide bicinchoninique

77
Dosage de protéines particulières
- dosages turbidimétrique ou néphélémétrique
laser après immunoprécipitation,
- dosage radio-immunologique avec marqueur
isotopique,
- dosage immunologique avec marqueur « froid
» : enzyme, composé fluorescent, composé
chimiluminescent.

78
• Dosages turbidimétrique ou néphélémétrique laser après
immunoprécipitation
- La réaction (protéine-anticorps) est effectuée dans un excès
d’anticorps
- Dans la turbidimétrie on mesure l’absorbance apparente de la
lumière
- Dans la néphélémétrie on mesure l’intensité de la lumière
diffusée
- Une courbe d’étalonnage est préparée en mesurant la
turbidité d’une série de solution standard contenant des
concentrations connues de la protéine

79
• Dosage immunologique
• Les principaux marqueurs utilisés
Système détecteur Exemple
Radio-isotopes Iodine-125, carbone-14,
tritium
Enzymes La raifort peroxydase,
alcaline phosphatase, β-
galactosidase
chimiluminescence Luminol, esters acridinium,
adamantyl dioxetane
bioluminescence Luciférinase/luciférine
Fluorescence Fluorescéine, rhodamine
Europium chélates
80
• La turbidimétrie est identique à la photométrie
d'absorption car on évalue la diminution d'intensité
de la lumière incidente lorsqu'elle traverse le milieu
trouble, la lumière transmise étant mesurée dans la
même direction que la lumière incidente.

81
• - La néphélémétrie évalue la diffusion de la lumière
sur les particules du milieu trouble, qui dépend de la
taille des particules, de leur indice de réfraction, de
la longueur d'onde de la radiation incidente, émise
ou non par un laser. La lumière diffusée est mesurée
dans une direction différente de celle de la lumière
incidente, avec un angle variable suivant les
appareils du commerce.

82
ELISA

Élimination
du sérum

Réaction colorimétrique

Substrat
Chromogène Produit coloré
(ABTS®)

83
• Electrophorèse des protéines plasmatiques
Protéinogramme
L'électrophorèse consiste à faire migrer et à fractionner grâce
à un champ électrique, au sein d'un milieu variable et dans un
tampon de pH déterminé, les protéines sont séparées selon
leur charge électrique.

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La technique consiste à;
déposer quelques microlitres de sérum sur le support,
à choisir un tampon, qui est généralement à pH 8,6
auquel les protéines s'ionisent comme des anions,
migrant donc vers l'anode, à laisser migrer durant un
temps fonction du support : 15 à 25 minutes pour
l'acétate, 30 à 60 minutes pour le gel de
polyacrylamide.

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• Fixation et coloration sont
habituellement faites avec le même réactif.
Cependant le colorant varie avec la nature des
composants à révéler.
Pour le protéinogramme standard les colorants les
plus utilisés sont l'amidoschwarz, le vert de
lissamine, le rouge Ponceau ou le bleu de Coomassie.

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Après transparisation du support, la lecture
photodensitométrique de la coloration de chaque
bande donne le tracé classique (figure) où
apparaissent les 5 pics : Albumine, α1, α2, β et y-
globulines.
L'intégration de la surface de chaque pic conduit enfin à
un pourcentage de chaque fraction, traduit aussi en
gramme/litre si le taux des protéines totales a été
donné à l'appareil.

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• Immunoélectrophorèse et immunofîxation
L'analyse immunoélectrophorétique
Après séparation des protéines par le champ
électrique, on dépose les anticorps (immunsérum
anti-protéines plasmatiques humaines, ou
immunsérums spécifiques de telle ou telle protéine)
dans une gouttière parallèle à l'axe de migration. La
rencontre Ag-Ac se traduit, après la diffusion, par un
arc de précipitation.

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• L'immunofixation
L'électrophorèse des protéines en gel d'agarose est
suivie par une immunoprécipitation in situ des
immunoglobulines avec des antisérums spécifiques de
chaque isotype incubés à la surface du gel.

Sur un même gel six pistes du même échantillon


subissent l'électrophorèse puis cinq pistes sont
recouvertes chacune d'un immusérum monospécifique
(anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-K, anti-ʎ), la dernière
piste étant mise en contact avec un réactif fixateur des
protéines pour servir de référence.

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91
Méthodes de dosage des glucide

• Glycémie;
Glycémie et glycosurie sont des urgences techniques : tout
milieu biologique contient toujours assez d'enzymes
glycolytiques pour dégrader le glucose présent et engendrer
rapidement une erreur par défaut : la conservation de
l'échantillon prélevé en l'absence d'agent inhibiteur de la
glycolyse ne doit pas dépasser une heure.

La glycémie peut être dosée aussi bien sur sang total


héparine que sur sérum.

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• Le contenu d'un tube capillaire héparine suffit largement,
récolté à la pulpe du doigt après coupure par vaccinostyle
ou au talon pour le nourrisson.

• Lorsque l'échantillon doit attendre plus d'une heure,


entre le prélèvement et l'analyse, le sang doit être
recueilli sur un inhibiteur de la glycolyse (fluorure de
sodium qui est un antiglycolytique par formation d'un
complexe fluorophosphomagnésien éliminant du milieu
le magnésium indispensable à l'action de l'énolase).

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• Le prélèvement doit être effectué chez un sujet
strictement à jeun depuis 10 heures.

• Le glucose doit être comprise entre 0.70 et 1.10 g.l. En


dessous, on parle d'hypoglycémie, au dessus,
d'hyperglycémie. En cas de valeur située entre 1.1 et
1.26, une intolérance au glucose est suspectée et si ce
taux est supérieur à 1.26 après un nouveau contrôle, on
parle de diabète, pathologie due à un problème au
niveau de l'insuline.

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• Méthodes de dosage
Les méthodes enzymatiques représentent 99 % des
techniques utilisées. 80 % utilisent la glucose oxydase, 7 %
l'hexokinase.
Méthode à la GOD/POD :

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GLUCOSE OXYDASE PEROXYDASE

COMPLEXE ROUGE
RÉACTIF RÉDUIT INCOLORE absorbe à 525 nm

Schéma réactionnel par la méthode de Trinder.

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Cette méthode peut aussi être réalisée à l'aide de bandelettes
réactives dont l'extrémité, imprégnée de réactifs,reçoit une
goutte de sang. La variation de coloration est appréciée soit
visiblement à l'aide d'une échelle colorée soit par un lecteur
portable indépendant et elle permet d'estimer la valeur de la
glycémie.

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Méthode mesure de la production de l’oxygène par
une électrode

Schéma réactionnel avec mesure de la production d'oxygène.

La vitesse d'apparition de l'oxygène est mesurée à l'aide


d'une électrode sélective.

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D'autres méthodes mettent en jeu des réactifs à base de
coenzymes nicotiniques comme indicateurs.

Schéma réactionnel avec lecture à 340 nm.


99
• Dosage des triglycérides
Elles reposent sur le dosage enzymatique colorimétrique du
glycérol libéré après action de la lipase.

4H2O

La lecture colorimétrique est effectuée à 540 nm.

100
• Dosage du cholestérol
• Le cholestérol peut être dosé par de très nombreuses
méthodes. Les plus anciennes sont colorimétriques, les plus
pratiquées sont enzymatiques.
• La méthode de référence est chromatographique.

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• Elles utilisent toutes une cholestérol estérase
et une cholestérol oxydase.

Cholestérol
CE CL + AG
Estérase

O2, Cholestérol oxydase


CL cholestène-4, 3H2O2

(CE = Cholestérol estérifié)


(CL = Cholestérol libre)

H2O2 formée peut être dosée en présence de catalase ou peroxydase :


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2H2O2+ phénol + chromogène (amino 4 phénazone)
quinone imine

• La quinone imine obtenue ci-dessus est colorée en rose et


peut être dosée par colorimétrie à 540 nm

• La coloration obtenue est proportionnelle à la concentration


du cholestérol sérique.
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• Dosage des acides gras libres
II s'agit d'un dosage colorimétrique comportant 3 réactions
successives :

La lecture colorimétrique est encore effectuée à 540 nm.

104
• Dosage du cholestérol HDL

II s'effectue après précipitation sélective des LDL et


VLDL avec un complexe polyanion-cation ou avec
l'acide phosphotungstique en présence de cations
bivalents.

• Le cholestérol HDL est dosé par technique


enzymatique sur le surnageant résultant de la
centrifugation du précipité.

105
• Dosage des enzymes
Principe général de la mesure d'une activité
Pour déterminer l'activité enzymatique d'une enzyme on utilise
la réaction catalysée par l'enzyme et l'on dose la quantité de
produit formé ou la quantité de substrat détruite au cours
d'un temps déterminé (la minute).

• Méthodes colorimétriques en point filanal


• Méthode colorimétrique en cinétique
• Introduire un coenzyme nicotinique (NAD, NADH.H+)

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• Méthode calorimétrique en point final
Exemple : phosphatases alcalines déterminées par la méthode
de Bodansky.
Les phosphatases alcalines agissent sur le (3 glycérophosphate
pour le transformer en glycérol et acide phosphorique. Le
dosage en point final des phosphates produit une coloration
proportionnelle à la quantité de phosphatases alcalines dans
le sérum.

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• Méthode colorimétrique en cinétique
Exemple : phosphatases alcalines déterminées par la méthode
de Bessey Lowry.
phosphatase
Paranitrophényl phosphate + H2O ————> paranitrophénol +
acide phosphorique

La vitesse de formation du paranitrophénol est


proportionnelle à la quantité d'enzyme dans le sérum.

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• Introduire un coenzyme nicotinique (NAD,
NADH.H+)

• Exemple Détermination de l'activité aspartate 2


oxoglutarate aminotransférase TGO

Les deux réactions suivantes sont couplées :

TGO
1) L-aspartate + a-cétoglutarate oxaloacétate + L-
glutamate

MDH
• 2) Oxalaoacétate + NADH+ L-malate +
NAD+

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Dans les liquides biologiques, les résultats sont
exprimés en unités internationales (UI) ou en unités
par litre (U/l). Une nouvelle unité doit remplacer
l'unité internationale, le katal.

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