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ANOMALIES MOLÉCULAIRES DES

HÉMOGLOBINOPATHIES

CONTRÔLE GENETIQUE DE L’HEMOSTASE

PREVENTION DES MALADIES


HEREDITAIRES
LE 09/04/2020
CC-BY Dr Meddeb Rym, FMT.
Service des maladies congénitales et
héréditaires HCN
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Définition des hémoglobinopathies
• Maladies héréditaires monogéniques
• Anomalies génétiques de la globine
Locus  globine: 16p13; Locus  globine : 11p15

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Activation séquentielle des gènes (sac vitellin-MO)
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2 GRANDS GROUPES D’ANOMALIES DE l’Hb

• ANOMALIES QUANTITATIVES:

  thalassémies: réduction ou absence synthèse des chaînes 


 thalthal

 thalassémies: réduction ou absence synthèse des chaînes 


 thalthal

• ANOMALIES QUALITATIVES:

HbS drépanocytose………………6 GluVal


HbC …………………………………6 GluLys
HbOArab……………………………121 GluLys
HbD punjab…………………...…....121 GluGln
HbE ………………………………….26 GluLys
HbG(philadelphie)…………………68 AsnLys

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La drépanocytose: Hb S
• Mutation: transversion d’A par T; exon 1;
codon 6 du gène de la  globine
• Ac glutamique (Glu) est remplacée par une
valine(Val)
• Mutation universelle: monoallélisme
codon 5 codon 6 codon7
 A CGT GAG GAG
 S CGT GTG GAG

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• Quelle est la technique de biologie
moléculaire la plus simple qu’on peut
utiliser pour l’étude génétique de cette
maladie?

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Diagnostic moléculaire
1. PCR-RFLP (Restriction Fragment Lengh Polymorphism)
PCR, Restriction, Electrophorèse

Package
restriction.exe

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400 pb
250 pb
150 pb

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Identification de mutations par
utilisation d'enzymes de restriction
• Amplification d’un fragment de 256pb (promoteur+exon1) gène 
globine
• Site de restriction MstII sur le codon 6
• Normal: 200pb + 56pb
• Hétéro: 200pb + 56pb + 256pb
• Malade: 256pb

N HTZ M

256 pb

200 pb

56 pb

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Mme est enceinte à 13 SA , un diagnostic prénatal a été proposé et l’étude
moléculaire chez le fœtus a révélé le profil suivant :

344 pb
201 pb

143 pb

Quel est votre conseil génétique?

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Diagnostic moléculaire des Beta Thalassémies
• En Tunisie, elle sont plus fréquentes que α- thalassémies
• Mutations ponctuelles> délétions
• Près de 200 mutations ponctuelles ont été caractérisées.
• variations inter population et intra population.
définir au préalable le spectre mutationnel

Mutations Type Fréquence % Origine


Codon39(CT) 0 49 Méditerranéenne
IVSI-110(GA) + 21 Méditerranéenne
IVSI-1(GA) 0 4,5 Méditerranéenne
Cd44(-c) 0 3,8 kurde
Codon30(GC) + 3,2 Tunisienne
IVSI-2(TG) 0 3 Tunisienne
IVSII-745(CG) + 2,6 Méditerranéenne
Cd6(-A) 0 2,6 Méditerranéenne
-87(CG) + 1,7 Méditerranéenne
IVSI-5(GA) + © 2020, Dr RYM
1,5MEDDEB, FMT.
Méditerranéenne
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Techniques de diagnostic moléculaire
•Plusieurs techniques, dérivées de la PCR, peuvent être utilisées pour
l'identification des mutations ponctuelles comme:
- l'hybridation par un oligonucléotide allèle-spécifique (ASO)
-l'amorçage allèle-spécifique (ARMS).

•Les grandes délétions peuvent être identifiées par la MLPA

Avec l'utilisation de séquenceurs d'ADN opérant par


électrophorèse capillaire, ces études préliminaires tendent
aujourd'hui à être abandonnées ..

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ASO : Allele Specific Oligonucleotide
Hybridation de sondes spécifiques d’allèles

1. La technique du "dot-blot"

INDICATION: populations où existe une mutation largement


dominante et un petit nombre de mutations rares.
 Amplification du fragment cible puis fixation sur une
membrane de nylon (BLOT) sous forme de spot (DOT)
 Synthèse de deux oligonucléotides marqués : un est
complémentaire à l’allèle normal et

l’autre est complémentaire à l’allèle muté


 Lavage des membranes et combinaison des résultats des
2 hybridations
 Un patient HMZ malade s'hybridera à la séquence
mutée et non à la séquence normale.
 Un HTZ s'hybridera aux deux sondes.

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2. RDB: Reverse Dot blot
• INDICATION: rechercher plusieurs mutations en une
seule étape d'hybridation.

les sondes oligonucléotidiques spécifiques ne sont pas


marquées, mais c'est un fragment d'ADN amplifié,
porteur du gène à étudier, qui est marqué

• Un certain nombre de sondes, spécifiques des


principales mutations présentes dans une région, et de
leurs allèles normaux sont greffés sur la membrane de
nylon sous forme de bandes ou de taches bien
identifiées.

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MLPA: AMPLIFICATION MULTIPLEX DE
SONDES DEPENDANTE D’UNE LIGATION

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MLPA
amplification multiplex de sondes dépendant d'une ligation

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MLPA

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• https://www.youtube.com/watch?v=gfLJxK
uqleY

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Le séquençage selon la technique de Sanger
++++
• Des nucléotides légèrement
différents sont utilisés: les
didésoxyribonucléotides (ddNTP) au
lieu des (dNTP).

• Les ddNTP diffèrent par l'absence


d'un groupement OH en position 3’.

• Ainsi lorsqu'une ADN polymérase


utilise un ddNTP, elle n'est plus
capable de rajouter le moindre
nucléotide à sa suite : la synthèse
du brin d'ADN s'arrête.

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Prévention

• Le conseil génétique (calcul de risque)


• Le diagnostic prénatal
• Dépistage des hétérozygotes
• Education de la population

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GÉNÉTIQUE DES
HÉMOPHILIES

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GENETIQUE DE L'HEMOPHILIE
• Le mode de transmission de la maladie est de
caractère récessif lié au chromosome X.
L'atteinte exclusive des garçons est habituelle
mais non obligatoire.
• Elle tient à la rareté des mariages entre un
hémophile et une conductrice qui pourraient
donner naissance à des filles homozygotes donc
malades.
• Les néo-mutations sont à l'origine de formes
sporadiques de la maladie, évaluées à au moins
30 % des cas.
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DETECTION DES CONDUCTRICES DE
L'HEMOPHILIE
DONNEES GENEALOGIQUES

• Les conductrices obligatoires: sont les filles d'hémophiles,


les mères de deux enfants hémophiles, les mères d'un
enfant hémophile apparentées à des hémophiles.

• Les conductrices potentielles: sont les femmes


apparentées à des hémophiles (soeur, cousine et tante
d'hémophiles) mais qui n'ont pas donné naissance à un
enfant malade ou ne sont pas filles d'hémophile,
• une mère d'un seul hémophile sans antécédent familial
d'hémophilie est conductrice potentielle (dans ce dernier
cas, il peut s'agir d'une mutation de novo au niveau des
gamètes de la mère).
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DIAGNOSTIC MOLECULAIRE
• L'étude par biologie moléculaire du gène du F VIII ou du FIX
permet seule un diagnostic de certitude.

• Analyse directe: Les anomalies génétiques sont multiples


- le Southern Blot et le séquençage du gène permettent la
mise en évidence de l'anomalie responsable de l'hémophilie

• Analyse indirecte: lorsque l'anomalie génétique de la famille


n'est pas connue (non étudiée) ou que le séquençage n'a pas
permis de retrouver la mutation causale
*Repérer le chromosome X porteur de l’anomalie génétique
peut être fait sur la mise en évidence de polymorphismes intra
ou extragéniques utilisés comme marqueurs indirects:
moindre degré de fiabilité.

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LE CONSEIL GENETIQUE

Evaluer la probabilité qu'une femme a


d'être conductrice et l'informer du risque
pour sa descendance.

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LE DIAGNOSTIC ANTENATAL

• Dans les formes sévères de l'hémophilie,


il est de pratique courante.
• Analyse génétique des cellules prélevées
par ponction throphoblastique entre la 11e
et la 13e semaine de grossesse ou sur LA
prélevé entre la 16e et la 18e semaine de
gestation.
• Détermination du sexe fœtal (première
étape du diagnostic prénatal)
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• Soit l’arbre généalogique suivant où les sujets II2 et II3 sont
atteints d’hémophilie A. Mme II4 est enceinte de 12 SA.

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Quelles sont les personnes conductrices obligatoires de la
maladie. Expliquer pourquoi

I2 et III1

Une étude moléculaire est réalisée dans cette famille avec 4


marqueurs polymorphes de l’ADN encadrant le gène de la
maladie. Le taux de recombinaison entre ces marqueurs et le
gène de la maladie est nul. Les résultats sont comme suit.
Quel est l’haplotype lié à la maladie
Quel conseil génétique donneriez vous à II4.

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1 2 A
2 1 B
4 2 C
3 4 D

2 3
1 1
2 2
4 1

1 3
2 1
4 5
3 2

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