Cours de Génétique Appliquée

I. Introduction au génie génétique

Le Génie Génétique
Définition : Ensemble des méthodes permettant de modifier le matériel génétique d¶une cellule par la manipulation de gènes in vitro BUT: Connaître la structure et le fonctionnement de l¶information génétique (ADN) d¶un animal ou d¶un végétal Isoler des gènes afin de les transférer dans une autre molécule d¶ADN appartenant à une autre espèce animale ou végétale

Bref historique du génie génétique

1868 : découverte de l¶ADN par Miescher 1953 : découverte de la structure de l¶ADN & du modèle de la double hélice par Watson & Crick 1961 : découverte du code génétique qui permet de comprendre que le « langage » de l¶ADN correspond au « plan de construction des êtres vivants »

Bref historique du génie génétique
1971 : découverte des endonucléases (= enzyme servant aux bactéries pour dégrader l¶ADN d¶organismes parasites) par Arber = « ciseaux biologiques » qui permettent de couper l¶ADN de façon très précise 1972 : premier ADN recombinant (ou produit de manipulation génétique in vitro) 1977 : premier clonage (ou reproduction in vitro) première localisation sur un chromosome de gène humain

Bref historique du génie génétique

1982 : mise sur le marché du 1er agent thérapeutique génétique (Insuline) 1983 : transfert de gène chez un végétal 1999 : décryptage du premier chromosome humain (chromosome 22)

Le Génie Génétique
Universalité du code génétique : = code identique de la bactérie à l¶être humain Clonage de gène : = isoler un gène permet de permet de récupérer un fragment d¶ADN, par exemple un gène, à partir d¶un échantillon d¶ADN complexe et de grande taille  le multiplier  l¶étudier  fabriquer la protéine pour laquelle il code
Mais attention : le clonage d'animaux, voire d'êtres humains, n'a rien à voir avec le génie génétique !

La manipulation génétique
ADN

ADN à cloner
ADN plasmide

bactérie

Enzyme de restriction

ADN recombinant

Population de bactéries transgéniques produisant la protéine recombinée

Le Génie Génétique
Les techniques de bases du génie génétique sont :
Identifier un gène Cloner le gène du donneur dans une bactérie Caractériser le gène du donneur dans un système bactérien Modifier le gène du donneur Réintroduire le gène du donneur dans des cellules donneuses

Applications du génie génétique
Recherche biomédicale : cancer, résulte du dysfonctionnement de certains gènes Médecine prédictive : dépistage génétique (diagnostic pré-natal) Thérapie génique : remplacement d¶un gène anormal par un gène sain Ex : essai de traitement de la mucoviscidose

Applications du génie génétique
Mises au point de nouveaux médicaments : médicament de nature protéinique tels que l¶insuline (diabète) insuline fabriquée par le pancréas assure la pénétration du sucre dans la cellule manque d¶insuline = diabète héréditaire injections d¶insuline de porc ou d¶insuline synthétique risque d¶allergie et/ou d¶intolérance Solutions = fabrication d¶insuline humaine pure par des bactéries, des levures et/ou des animaux fiable, rapide, coût modique, quantité suffisante

Applications du génie génétique
Médecine préventive : fabrication de vaccins, dont l¶efficacité et l¶innocuité sont testés sur animaux transgéniques Agronomie : amélioration des espèces végétales et des espèces animales (rendements, qualité gustative ) conférer à des plantes une résistance à certains produits phytosanitaires (herbicides) ou a certains types d¶agressions (froid, insectes, sécheresse, sols acides, sols salé )

Les OGM
OGM : organisme vivant génétiquement modifié Un organisme dont le matériel génétique a été modifié d¶une manière qui ne s¶effectue pas naturellement par multiplication et/ou par recombinaison naturelle (Loi N°92.654 du 13 juillet 1992)

Application directe du génie génétique Le génie génétique permet ainsi de modifier, supprimer ou introduire certains caractères. Apporter une fonction nouvelle Inactiver ou augmenter une fonction déjà existant

Les OGM
Organismes vivants : Plantes et animaux y compris les champignons, les bactéries, les virus Les OGM correspondent à : des organismes ou parties d'organismes vivants qui sont capables de transférer ou de répliquer leur matériel génétique et peuvent ainsi se disséminer dans l'environnement par exemple dans le cas d'une plante, il s'agit aussi bien de la plante entière que des fruits, graines, pollens...

Les plantes transgéniques
Étude de l¶expression des gènes et de leur fonctionnement au cours du développement de la plante Impact au niveau environnemental et agricole : La La La La La protection des cultures résistance des plantes aux insectes tolérance des plantes aux herbicides résistance aux maladies résistance aux conditions climatiques extrêmes

Voir chapitre « Ingénierie des plantes »

Les animaux transgéniques
Essentiellement des souris (99%) Étude de souris transgéniques capables de développer

˜ cancers ˜ maladies neuro-dégénératives graves (Alzheimer,
Parkinson )

˜ maladies génétiques (diabète, mucoviscidose ) ˜ maladies infectieuses (SIDA, hépatite )
BUT : reproduire les maladies humaines et les étudier afin de trouver des traitements

Critères d¶application du génie génétique
La sécurité des personnes La sécurité de l¶environnement La nécessité de soigner L¶absence de discrimination entre les individus Le traitement éthique des animaux de laboratoire Le droit de l¶être humain à la recherche et à la connaissance

II. Comment récupérer de l¶ADN ?

L¶ADN
ADN (Acide désoxyribonucléique)

Molécule présente dans toutes les cellules des êtres vivants Formée de deux doubles brins (double hélice) Deux extrémités différentes (3¶-OH et 5¶-P) Action des enzymes relatives à l¶ADN ne se fait que dans un sens

Chromosomes & ADN
Pendant division cellulaire : ADN concentré en structures bien visibles au microscope = chromosomes : vecteurs du patrimoine génétique 46 chromosomes dans le noyau des cellules humaines ADN non condensé = longs filaments ou doubles brins formant une échelle dont les barreaux sont des couples de molécules A-T : Adénine ± Thymine C-G : Cytosine ± Guanine
G T C A

Précautions à prendre
Éviter l¶hydrolyse de l¶ADN par les endonucléases (DNAses): DNAses endogènes (= libérées lors de la lyse des cellules) DNAses exogènes (= en général, bactérie présentes sur la peau)

Travailler avec des produits complexants (ex : EDTA) de certains ions comme le Ca2+ et le Mg2+ nécessaires à l¶activité des DNAse Travailler de manière « propre » (matériel et tampons stérilisés, avec des gants« )

Précautions à prendre
Limiter les cassures mécaniques Eviter l¶agitation trop violente des solutions d¶ADN

Limiter la dénaturation thermique Éviter l¶exposition de l¶ADN à des températures supérieures à 80°C Éviter les séjours prolongés à température ambiante Travailler à 4°C, si possible

Extraction de l¶ADN
1. Lyse cellulaire :    Utilisation de détergents (SDS, Triton X100) qui désorganisent les membranes cellulaires (plasmiques, nucléaires ) Bactéries : ajout de lysozyme qui détruit leur paroi Végétaux : congélation dans l¶azote liquide & broyage (mortier)

2. Dissociation des protéines   Utilisation d¶un détergent dénaturant comme le SDS (sodium dodécylsulfate) Action d¶une protéase : la protéinase K

Extraction de l¶ADN
3. L¶élimination des protéines  Utilisation de solvants (phénol/chloroforme, phénol/alcool)  Dénaturation des protéines

Phase aqueuse

ADN et ARN protéines

Phase organique (phénol-chloroforme)

protéines et lipides

Extraction de l¶ADN
4. Élimination des ARN  Utilisation d¶une enzyme, la RNAse, dépourvue d¶activité DNAse 5. Précipitation de l¶ADN :  Solution éthanol 70% et acétate de sodium Na2+ 0,1M  Obtention d¶ADN sous forme solide  Laver le précipité pour éliminer les sels  Dissolution dans un tampon stérile à pH 7-8 contenant de l¶EDTA  Eviter les congélations-décongélations successives de l¶ADN

Extraction de l¶ADN

Pureté de l¶extrait de l¶ADN
Rapport A260nm/A280nm : dosage au spectromètre  Spectre UV d¶absorption de l¶ADN : min 230 nm et max à 260 nm  Dosage des protéines à 280 nm  Rapport Abs260/Abs280 = qualité de l¶extrait 

1,8 < Abs260/Abs280 < 2 = extrait d¶ADN pur  Abs260/Abs280 < 1,7 = présence de protéines  Abs260/Abs280 > 2 = présence d¶ARN

Pureté de l¶extrait de l¶ADN
Spectre d¶absorption de l¶ADN dans l¶UV
absorbance

Contaminations protéiques : 280 nm phénol : 270 nm glucides : 230 nm

Dosage de l¶extrait d¶ADN
Dosage par absorptiométrie UV de la concentration en ADN mesure effectuée à 260 nm ADN pur double brin : 1 unité d¶absorbance correspond à 50 µg/mL Concentration en ADN : [ADN] en µg/mL = A260nm x 50 x facteur de dilution

Dosage de l¶extrait d¶ADN
Estimation de la concentration en ADN par fluorescence en présence de BET BET (bromure d¶éthidium) : s¶intercale entre les bases de l¶ADN et fluoresce sous UV. Intensité de la fluorescence est proportionnelle à la concentration en ADN Dosage fluorimétrique : Technique sensible mais nécessite l¶utilisation d¶un fluorimètre. Dosage de l¶ADN en présence de BET et comparaison avec solution standards

Extraction de l¶ADN plasmidique
Plasmide bactérien Petite molécule d¶ADN Bicaténaire Circulaire Extra-chromosomique
bactérie ADN

plasmide

Réplication indépendante du génome de l¶hôte Vecteurs les plus fréquents de l¶ADN cloné en génie génétique

Extraction de l¶ADN plasmidique

Extraction de l¶ADN plasmidique
En résumé, 3 grandes étapes :

1. Croissance des bactéries Amplification des plasmides : Chloramphénicol : antibiotique ajouté en fin de phase exponentielle Il arrête la synthèse protéique, tandis que les plasmides continuent de se répliquer

Extraction de l¶ADN plasmidique
2. Lyse des bactéries = libération des plasmides Idem extraction ADN génomique mais séparation de l¶ADN plasmidique de l¶ADN génomique Obtention d¶une solution avec ADN pré-purifié = lysat clair 3. Purification de l¶ADN plasmidique élimination des protéines résiduelles (phénol / chloroforme) hydrolyse de l¶ARN (RNAse)

I.

Introduction au génie génétique

II. Comment récupérer l¶ADN ?

III. Comment Isoler un gène ?

Comment isoler un gène ???

ADN : ressemble à une pelote visqueuse. Comment isoler un gène de cet enchevêtrement de fils ?

ADN de méduse

Technologie de l¶ADN recombinant
ADN

ADN à cloner
ADN plasmide

bactérie

Enzyme de restriction

ADN recombinant

Population de bactéries transgéniques produisant la protéine recombinée

1. Les enzymes utilisées en génétique

Les enzymes utilisées en génétique

Couper l¶ADN = nucléases Coller l¶ADN = ligases Recopier l¶ADN = ADN polymérase Modifier l¶ADN = phosphatase, kinases «

1.1. Les enzymes de coupures : les nucléases
Exonucléases Endonucléases

Coupe l¶ADN = simple ou double brin Nombre de brins coupés = 1 ou 2 brins Extraites de diverses souches bactériennes

phage Endonucléases

bactérie

ADN bactérien

Exonucléases non-spécifiques non- 

Exo III : exonucléase double brin, coupe à l¶extrémité 3¶  Exo L : exonucléase double brin, coupe à l¶extrémité 5¶ 3¶

Endonucléases non-spécifiques non- 

La DNAse : endonucléase qui peut couper l¶ADN double brin ou simple brin au hasard.

Si Mg2+, attaque chaque brin d¶ADN indépendamment Si Mn2+, attaque les deux brins de l¶ADN

Endonucléases spécifiques : les enzymes de restriction
Enzyme de type I : l¶enzyme reconnaît la séquence, se déplace sur l¶ADN et coupe de manière aléatoire 1000 à 4000 paires de base plus loin. Enzyme de type II : coupe au niveau de la séquence reconnue Enzyme de type III : l¶enzyme reconnaît la séquence et coupe l¶ADN 20 à 25 paires de base plus loin

Seules les enzymes de type II sont utilisées en génie génétique

Nucléases spécifiques : les enzymes de restriction
fragment de restriction palindrome (RADAR, KAYAK )

Bouts francs =

SmaI

Bouts

collants » avec des extrémités cohésives =

EcoRI

Nucléases spécifiques : les enzymes de restriction
Exemple de l¶enzyme EcoRI

5¶-GAATTC-3¶ 3¶-CTTAAG-5¶

5¶-G AATTC-3¶ 3¶-CTTAA G-5

Nucléases spécifiques : les enzymes de restriction

Nucléases spécifiques : les enzymes de restriction
Nomenclature des enzymes de restriction Exemple EcoRI : 1ère lettre : majuscule, initiale du genre de la bactérie E : genre escherichia 2ème et 3ème lettres : minuscules, désigne l¶espèce de la bactérie co : espèce coli 4ème lettre : pas toujours présente, désigne la souche bactérienne R : souche RY13 Un chiffre romain : ordre de découverte I : première enzyme isolée

Nucléases spécifiques : les enzymes de restriction
Visualisation des fragments de restriction en gel d¶agarose

Gel d¶agarose Cuve d¶électrophorèse

Électrophorèse des fragments de restriction

1

2

3

MT

1: enzyme de restriction 1 2: enzyme de restriction 2 3: ADN non digéré MT: marqueur de taille

Carte de restriction

Applications : la technique RFLP
Technique RFLP: polymorphisme de restriction de l¶ADN. (restriction fragment length polymorphism): Technique d¶analyse de la séquence d¶ADN: des substitutions des délétions des insertions des modifications entre deux séquences proches

Applications : la technique RFLP

1.2. Les enzymes qui lient : les ligases
Ligase

1.2. Les enzymes qui lient : les ligases
liaison phosphodiester entre extrémités 5¶ et 3¶

effectuent des ligatures sur des fragments d¶ADN avec  bouts francs  des bouts collants (ou extrémités cohésives)

ligases plus efficaces en face d¶extrémités cohésives

1.3. Les enzymes de synthèse
a. Les ADN polymérases classiques »

Enzymes qui recopie une chaîne d¶ADN Synthèse du nouveau brin dans le sens 5¶J 3¶ Synthèse complémentaire et antiparallèle Nécessite la présence de dNTPs : dATP, dCTP, dGTP, dTTP Possède les deux activités exonucléasiques : 5¶ 3¶ 3¶ 5¶

1.3. Les enzymes de synthèse
Fragment de KLENOW : enzyme préparée à partir de l¶ADN polymérase I propriétés polymérasiques propriétés exonucléasiques 3¶ 5¶

ne possède plus d¶activité exonucléasique 5¶ 3¶ = évite de dégrader l¶ADN synthètisé

1.3. Les enzymes de synthèse
b. La reverse transcriptase (RT) Permet l¶obtention d¶un ADNc à partir d¶un ARN messager ARN dépendante Possède une activité RNAse Pas d¶activité exonucléase 3¶ 5¶

1.3. Les enzymes de synthèse
c. La Taq polymérase ADN polymérase isolée de bactéries vivant dans des sources d¶eau chaudes = thermostables (75-80 °C) Pas d¶activité d¶édition : = mésappariements (1/100 bases) Utilisation principale = PCR (polymerase chain reaction)

1.4. Les enzymes qui modifient l¶ADN
a. Terminal désoxy-nucléotidyl-transférases désoxy-nucléotidyl-

ADN + dGTP terminal transferase + dCTP

1.4. Les enzymes qui modifient l¶ADN
a. Terminal désoxy-nucléotidyl-transférase désoxy-nucléotidylEnzyme qui permet d¶ajouter des nucléotides à l¶extrémité 3¶ de l¶ADN Ajout d¶au moins 3 nucléotides identiques Ne nécessite pas de modèle Technique de « queuttage » pour obtention d¶extrémités cohésives

1.4. Les enzymes qui modifient l¶ADN
b. Les kinases enzymes qui phosphorylent transfert d¶un groupement phosphate à partir d¶une molécule d¶ATP transfert à l¶extrémité 5¶ utilisé pour marquer l¶ADN : Incorporation de phosphore radioactif (P32) sur l¶extrémité 5¶ d¶un acide nucléique.

1.4. Les enzymes qui modifient l¶ADN
c. Les phosphatases

1.4. Les enzymes qui modifient l¶ADN
c. Les phosphatases

hydrolyse le groupement phosphate situé en 5¶ large spécificité de ces enzymes réaction irréversible utilisées pour préparer de l¶ADN recombinant

1.4. Les enzymes qui modifient l¶ADN
d. Les topoisomérases enzyme qui modifient le nombre d¶enlacements de l¶ADN capable d¶introduire ou d¶éliminer des supertours dans la double hélice couper 1 ou 2 brins d¶ADN pour modifier le nombre de supertours puis le reconstitue topoisomérases I : coupent un seul brin d¶ADN topoisomérases II : coupent deux brins d¶ADN

Enzymes : conclusions

4 grandes familles d¶enzymes + quelques autres molécules qui aident à isoler les gènes activité précise ADN = cible des ces enzymes origine biologique (virus, bactéries, plantes )

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