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Phase pré-analytique en

hématologie

Dr RAHALI Fatima Zahra


Pr CHAKOUR Mohamed
Laboratoire d’hématologie biologique
Hôpital Avicenne - Marrakech
PLAN
I. Introduction
II. Phase pré-analytique en hémostase
III. Phase pré-analytique en numération et cytologie sanguine
IV. Phase pré-analytique en cytologie médullaire
V. Phase pré-analytique en immunohématologie
VI. Conclusion
Introduction
 Processus analytique : 3 grandes étapes enchaînées

 Phase pré-analytique : phase complexe recouvrant l’ensemble


des étapes qui se déroulent depuis la prescription médicale
jusqu’à l’analyse de l’échantillon au laboratoire.
 2 étapes dans la phase pré-analytique :
- étape externe au laboratoire : prescription de l’examen, choix
du matériel, prélèvement, identification, acheminement.
- étape interne au laboratoire : réception de l’échantillon,
vérification des non conformités, préparation de l’échantillon.
 Intérêt :
- Source de 70% des résultats erronés
- Toute défaillance de cette phase aura des répercussions sur
la phase analytique et post-analytique.
- Responsabilité du biologiste : maîtrise de la phase pré-
analytique.
- Garant principal de la fiabilité des résultats en hématologie
biologique.
Phase pré-analytique en hémostase
I- Prescription
1) Rationalisation de la prescription :
• Éviter une fausse interprétation des résultats
• Exemple :
- D-Dimères : augmentation physiologique après un acte
chirurgical, traumatisme, grossesse, accouchement,
contexte infectieux
- FvW : augmente au cours de la grossesse
- Protéine S : diminue au cours de la grossesse
2) Renseignements cliniques :
• Mentionnés sur le bon de prescription
• Nécessaires à l’interprétation du bilan d’hémostase :
 Âge :
- À la naissance : Facteurs Vit K dépendants représentent 50%
de la valeur normale
- Sujets âgés : taux de D-Dimères élevé
 Sexe :
Femmes et maladie thromboembolique veineuse
 Statut physiologique actuel : grossesse
 ATCDs personnels / familiaux de manifestations
hémorragiques
 Motif de demande : bilan préopératoire, exploration d’un
syndrome hémorragique, surveillance du traitement
anticoagulant
 Maladie sous-jacente : IR, hépatite, cirrhose, lupus…
 Prise médicamenteuse : héparine, AVK
 Groupe sanguin : taux du FvW plus bas chez les patients de
groupe O
II- Prélèvement
1) Préparation du patient :
- Assurer le malade (le taux de fibrinogène augmente lors de
stress majeur)
- Prélèvement fait le matin, de préférence à jeûn (ou après
un repas léger sans matière grasse), sauf si urgence
- Éviter le café, tabac, alcool, exercice physique dans l’heure
qui précède le prélèvement
- Position assise, au repos pendant 5 min
- Pour l’étude de la fibrinolyse, la position couchée pendant
20 à 30 min est recommandée
2) Méthode du prélèvement :
 Site de ponction :
- Ponction veineuse franche au pli du coude
- Chez nouveau-né ou prématuré : prélèvement capillaire au doigt
ou au talon
- Prélever du côté opposé d’une perfusion (dilution du
prélèvement)
- Ne pas prélever sur cathéter (souillure par héparine). Si
nécessaire : rejet des 10 premiers millilitres + à mentionner sur
le bon de demande
 Aiguille :
- Calibre suffisant entre 19 à 22 G (0,7 à 1 mm) :
écoulement facile du sang

- Aiguilles à ailettes épicrâniennes :


o Enfants et patients difficiles à piquer
o Tubulure courte (< 6 cm)
o Prélever un tube de purge en premier

- Prélèvement à la seringue interdit pour l’hémostase :


o Remplissage secondaire des tubes
o Risque d’activation plaquettaire et de la coagulation
 Garrot :
- Peu serré (risque d’hémolyse)
- Durée de pose < 1 min (stase
veineuse prolongée)
- Desserrer dès que le sang afflue
dans le tube
 Choix des tubes :
- De préférence : système des tubes sous vide
o Prélèvement rapide et facile
o Le vide induit une aspiration violente  activation plaquettaire
o À ne pas utiliser pour les prélèvements destinés à l’étude des fonctions
plaquettaires.
- Tubes en verre siliconé ou en plastique
- Vérifier la date de péremption du tube, si périmé :
o Anticoagulant contaminé par les bactéries
o Altération de l’étanchéité  mauvais remplissage
 Anticoagulant :
- Nature de l’anticoagulant :
• Tubes citratés :
o Tubes à bouchon bleu
o Citrate de sodium : anticoagulant de référence pour
l’hémostase
o Inhibition insuffisante de l’activation plaquettaire  libération du F4P
qui neutralise l’héparine plasmatique  inconvénient dans la
surveillance des patients sous héparinothérapie
• Tubes CTAD :
o Citrate de sodium additionné d’inhibiteurs de l’activation plaquettaire
(théophylline, adénosine, dipyridamole)
o Limite la sécrétion plaquettaire (F4P)  pas de neutralisation de
l’héparine par le F4P  réservé au suivi des traitements hépariniques
- Concentration du citrate de sodium :
o 3,2% (= 0,109 M) et 3,8% (= 0,129 M)
o Il est recommandé d’utiliser la concentration 3,2%
o Les ISI des thromboplastines utilisés pour calculer l’INR sont
déterminés à partir d’échantillons sanguins prélevés sur citrate 3,2%
selon les recommandations de l’OMS  non valides pour des
échantillons collectés sur citrate 3,8% (INR majoré d’environ 10%)
o Selon GEHT :
• Citrate 3,2% recommandé
• Citrate 3,8% acceptable
• Recommande l’utilisation d’une concentration de citrate unique
pour un laboratoire de biologie médicale
- Volume de l’anticoagulant :
1 volume d’anticoagulant pour 9 volumes de
sang :
• Remplissage à 90% : recommandé
• Remplissage ≥ 80% : acceptable
• Remplissage < 80% : refuser le prélèvement

o Si tube peu rempli  plasma hypercitraté  temps d’hémostase


faussement allongés
o Si tube trop rempli  plasma hypocitraté  temps d’hémostase
raccourcis
- Hématocrite et anticoagulant :
o Le volume d’anticoagulant dans les tubes citratés est adapté à un
hématocrite entre 30% et 55%
o Si Hte < 30% : volume de plasma augmenté et volume
d’anticoagulant insuffisant  temps de la coagulation raccourcis
o Si Hte > 55% : volume de plasma diminué et volume
d’anticoagulant très important  faux allongement des temps de
la coagulation
o Formule de Mc Gann ou d’Ingram : détermination du volume
nécessaire d’anticoagulant

- pH du plasma anticoagulé :
o 7,3 < pH < 7,45
 Ordre des tubes :
Tubes d’hémostase : 2ième position

 Homogénéisation :
- Immédiate par retournements lents (3 à 4 fois)
III- Identification
- Au moment du prélèvement + Préciser l’identité et l’heure du prélèvement

IV- Conditions d’acheminement


 Transport :
o Prélèvements rapidement acheminés au laboratoire : l’idéal est
de 1 à 2h sans dépasser 4h
o Tubes maintenus en position verticale
o Éviter les agitations et les vibrations (hémolyse)
 Température :
o T° ambiante : entre 18°C et 22°C
o Le transport dans la glace fondante est proscrit
o Températures excessives : sources d’hémolyse
V- Prise en charge au laboratoire
1) Accueil des tubes :
- Vérifier les conformités et rejeter les échantillons non conformes :
o Absence d’identification
o Discordance entre étiquetage et l’identité marquée sur le bon de
demande
o Délai d’acheminement > 4h
o Tube inapproprié
o Prélèvement coagulé
o Prélèvement hémolysé
o Ratio anticoagulant / sang non respecté
2) Centrifugation :
- Idéalement dans l’heure qui suit le prélèvement
- Si l’étude de l’hémostase ne porte pas sur l’exploration
plaquettaire : Plasma pauvre en plaquettes  Une seule
centrifugation pendant au moins 10 min, à 2000 g jusqu’à
2500 g, entre 18 et 20°C.
- Si exploration plaquettaire : Plasma riche en plaquettes 
Centrifugation douce à 800 g pendant 10 min, entre 18 et
20°C.
- Double centrifugation séparée par une décantation du plasma
(permet d’assurer un nb de plaquettes résiduel < 10 G/L) :
o Si on envisage une congélation du plasma pour dosages différés
o Rechercher d’anticoagulant circulant de type lupique
- Après centrifugation  inspecter le plasma :
hémolysé, ictérique, lactescent.
3) Congélation :
- Lorsque les tests doivent être différés : centrifugation de
l’échantillon pour obtenir un PPP  congélation du plasma
dans des aliquots.
- La congélation doit s’effectuer rapidement à :
• -70°C jusqu’à 6 mois
• à défaut : à -20°C pendant moins de 2 semaines
4) Décongélation :
- Rapide, au bain marie, à 37°C pendant 5 min (jamais à
température ambiante ni au four micro-onde)
- Une fois décongelé, le plasma doit être homogénéisé et
immédiatement traité
- Un plasma décongelé ne doit pas être recongelé
VI- Recommandations GEHT
Recommandé Acceptable Non conforme
Tube  Sous vide Verre siliconé Autres
 Verre siliconé
 Bouchon serré
 Air résiduel < 20%

Anticoagulant Citrate 3,2% Citrate 3,8% Autres


CTAD
pH 7,3-7,45 <7,3 ou > 7,45
Taille d’aiguille 19-22 gauges 23 gauges (pédiatrie) > 25 gauges
Garrot < 1min 1-3min > 3 min
Peu serré Trop serré

Site de ponction Veineuse Artérielle Autres


Cathéter après tube de
purge
Recommandé Acceptable Non conforme

Place du tube 2ème après tube de purge 1er tube Après tube sec avec
ou après hémoculture activateur ou autre
anticoagulant

Remplissage >90% ≥ 80% < 80%

Transport 18-22°C < 4°C ; > 37°C


Position verticale

Délai < 2h < 4h > 4h


< 4h : CTAD

Centrifugation 2000 – 2500 g au moins < 1500 g


10 min

Température de 15-25°C < 15° ou > 25°


centrifugation
Recommandé Acceptable Non conforme

Congélation Rapide à -70°C Rapide à -20°C Autres

Conservation des -70°C tube non - 20°C , < 15 jours > - 20°C
échantillons congelés mouillable ; bouchon à
vis

Décongélation Rapide à 37°C T° ambiante


Micro-onde
> 39°C
Phase pré-analytique en numération
et cytologie sanguine
I- Prescription
 Identité
 Sexe :
- Différence des valeurs normales des paramètres érythrocytaires
(Hg, GR) chez l’homme et chez la femme

 Âge :
- Modification physiologique de nombreux paramètres entre
l’enfance et l’adolescence
- Nouveau-né :
o Hg : jusqu’à 20 g/dl
o VGM : jusqu’à 120 fl
o GB : 30 G/L
- Lymphocytose physiologique :
o Nourrisson : jusqu’à 16,5 G/L
o Entre 2 et 4 ans : 9,5 G/L
- Prématuré :
o Érythroblastes circulants associés à une myélémie équilibrée
- Nouveau-né :
o Érythroblastes circulants
o Nombre modéré d’anomalies morphologiques des GR : schizocytes,
corps de Jolly
- Nourrisson :
o Variations morphologiques des lymphocytes normaux circulants en
dehors de toute infection virale : hématogones
 Facteurs pouvant modifier la NFS :
- En post prandial, effort physique, situation de stress, grossesse 
Polynucléose neutrophile physiologique
- Séjour prolongé en altitude : Polyglobulie secondaire
- Origine ethnique : race noire (neutropénie ethnique)
 ATCDs personnels :
- Hémopathie connue, Maladie de système, IR, IHC, atteinte thyroïdienne
- Habitudes toxiques : tabagisme , alcoolisme
- Prise médicamenteuse : chimiothérapie anticancéreuse …
- ATCDs chirurgicaux : splénectomie
 Degrés d’urgence
II- Prélèvement
Patient à jeûn depuis plus de 8h, sauf si urgence
Choix du tube :
- Anticoagulant de référence pour l’hémogramme :
o EDTA (acide éthylène diamine tétra-acétique)
o Adapté à l’hématologie cellulaire
o Inconvénient : agrégation plaquettaire liée à l’EDTA
o Sous forme de sel di ou tri-potassique (K₂ ou K₃ EDTA)
o Le conseil international pour la standardisation en hématologie
recommande le K₂ EDTA
- De préférence : tube en verre siliconé ou en plastique
- Sous vide
- Attention à la date de péremption
- Respect des conditions de stockage (T° ambiante autour de 20°C,
absence d’exposition à la lumière)
 Site de ponction :
- Ponction veineuse franche au pli du coude
- Prélever du côté opposé d’une perfusion (dilution du prélèvement)
 Garrot :
- Peu serré
- Durée de pose < 1 min
- Desserrer dès que le sang commence à arriver dans le tube
 Remplissage des tubes :
- Jusqu’au niveau du remplissage
- Le tube EDTA ne doit pas être trop rempli : volume d’air doit
représenter au moins 20% du volume du tube
 Ordre des tubes :
- Tube EDTA : parmi les derniers tubes après les tubes citratés, secs et
héparinés.

 Homogénéisation :
- Immédiate par retournements successifs lents (10 fois)
III- Identification
- Au moment du prélèvement
- Préciser l’identité et l’heure du prélèvement

IV- Conditions d’acheminement et de conservation


 Transport :
o Le plus rapidement possible au laboratoire
o Température de transport : T° ambiante
o Éviter les chocs mécaniques
 Conservation :
o Analyse de la NFS : dans les 6h après prélèvement
o Une ré-analyse de la NFS est possible dans un délai qui ne
dépasse pas 24h.
V- Prise en charge au laboratoire
 Accueil des tubes : Éliminer les non-conformités :
- Échantillons non identifiés
- Discordance entre identification sur bon de demande et celle sur
l’échantillon
- Tube inapproprié
- Quantité de sang insuffisante
- Prélèvement coagulé
- Prélèvement suspect d’être dilué par une perfusion
VI- Réalisation du frottis sanguin
1) Étalement :
- Réalisé à partir de sang prélevé sur EDTA (ne pas utiliser du sang
hépariné pour la préparation d’un frottis sanguin)
- Sang frais : étalement dans les 2h suivant le prélèvement, mais un
délai de 6h est tolérable en pratique
- Si étalement fait tardivement  lyse des GB
- Lames en verre, dégraissées, à bords rodés à 45°
- Confection du frottis sanguin : manuellement ou
mécaniquement à l’aide l’appareils automatiques
Technique manuelle
d’étalement
- Identification du frottis
- Laisser sécher à l’air libre (pas d’agitation ni séchoir)
- L’inclinaison de la lame effectuant le frottis varie selon l’hématocrite
(viscosité du sang) :
o Viscosité basse  tenir la lame plus verticalement (> 45°)
o Viscosité élevée  lame moins verticale (< 45°)
o Certains automates tiennent en compte l’hématocrite pour adapter
l’angle d’étalement
• Critères de qualité du frottis sanguin :
- Longueur : ½ ou ¾ de la lame
- Bonne densité : pas trop épais, ni trop mince
- Ne touchant pas les bords
- Étalement homogène
- Mouvement régulier
- Se terminer en pointe arrondie
- Sans franges terminales
• Frottis sanguins défectueux :

Frottis trop épais Frottis trop fin


Goutte non étalée en entier Franges terminales

Frottis non homogène Frottis strié


2) Coloration :
 May Grunwald-Giemsa classique (MGG classique) :
o Coloration de référence en hématologie
o Action de 2 colorants : May Grunwald (éosine + bleu de
méthylène) et Giemsa (éosine et azur de méthylène)
o Méthode :
- Verser sur le frottis le liquide MG de manière à bien le recouvrir
- Laisser agir pendant 5 min
- Rincer avec l’eau de robinet et laisser sécher
- Verser le liquide Giemsa dilué à 1/10ième
- Laisser agir pendant 20 min
- Laver à l’eau de robinet
- Laisser sécher le frottis à l’air libre en déposant la lame
verticalement
 Coloration rapide :
o Variante rapide de MGG
o Kit disponible de coloration rapide (vérifier date de péremption)
o Méthode :
- Plonger la lame pendant 5 secondes dans le flacon contenant un fixateur à
base de méthanol ; égoutter l’excédent sur papier
- Plonger la lame pendant 5 secondes dans le flacon d’éosine ; puis égoutter
- Plonger la lame pendant 5 secondes dans le flacon du bleu de méthylène ;
égoutter
- Rincer rapidement à l’eau de robinet
- Laisser sécher à l’air libre
 Coloration automatisée des frottis sanguins
 La coloration peut être différée dans le temps, mais au-delà de deux
semaines le résultat obtenu est de qualité moindre

 Frottis correctement coloré :


- Couleur beige rosée des hématies
- Cytoplasme transparent des polynucléaires
- Couleur neutrophile des grains des PNN
 Problèmes techniques de coloration :
o Coloration trop foncée  aspect bleu-verts des hématies ,
cytoplasme grisâtre des polynucléaires , granulations neutrophiles
foncées :
- Frottis épais
- Temps de coloration trop long
- Temps de lavage insuffisant
- pH trop alcalin

o Coloration trop pâle  Hématies rouge orangées :


- Temps de lavage excessif
- pH trop acide
VII- Recommandations
Recommandé acceptable Non conforme
Jeûne > 12 h Urgence : jeûne non Postprandial : fausse les
nécessaire constantes érythrocytaires

Anticoagulant K₃ ou K₂ EDTA Citrate ou CTAD (correction Autres anticoagulant, tube


de 10%) sec

Tube Plastique, verre siliconé, Tube non prélevé sous vide


sous vide
Microtubes : sang capillaire

Mélange sang / Sang non coagulé Sang coagulé


anticoagulant

Site Veineux (opposé à la Cathéter après rinçage Du coté d’une perfusion


perfusion)
Recommandé Acceptable Non conforme

Place de tube Parmi les derniers tubes Autre position

Température de transport T° ambiante + 4 °C

Délai avant l’analyse  NFS : <12h  NFS : 12-24h  NFS : > 24h
 Frottis : < 6h  Frottis : 6-12h  Frottis : > 12h
 Réticulocytes : < 24h  Réticulocytes > 24 h

Température de T° ambiante + 4 °C < 4 °C ou > 40°C


conservation

Frottis sanguin  Identification des lames Coloration non  Étalement > 12h
 Étalement dans les 6 h standardisée  Séchage accéléré
 Séchage : air libre  Colorant périmé
 Coloration MGG
Phase pré-analytique en
cytologie médullaire
I- Renseignements
 Identité
 Âge : Variation de la formule médullaire avec l’âge
 ATCDs : Pathologie chronique, hémopathie connue
 Prise médicamenteuse
 Examens complémentaires réalisés
 Indication du myélogramme
 Symptomatologie : Sd d’insuffisance médullaire, Sd tumoral, Sd
infiltratif …
 Un prélèvement sur tube EDTA doit systématiquement être associé à
la demande du myélogramme (NFS, Réticulocytes, Frottis sanguin)
 Prescripteur et ses coordonnés
II- Réalisation du myélogramme
 Patient rassuré, installé confortablement
 Préleveur : médecin formé et habile
 En lieu médicalisé
 Éliminer une contre-indication :
o ATCD de sternotomie (ponction sternale)
o Radiothérapie localisée en regard du site de ponction médullaire
o Lésion cutanée majeure
o Situation à risque : thrombopénie ou TTT anticoagulant  précaution :
compression prolongée après le geste
1) Ponction médullaire et étalement :
 Matériel :
o Trocart de type Mallarmé auquel est adapté une
seringue de diamètre et longueur variables (âge,
site de ponction)
o Seringue : de 10 à 20 ml, non anticoagulée
o Champ et compresses stériles
o Lames : en verre, dégraissées, à bords rodés à 45°
 Site de ponction :
o Sternale (adulte)
o épine iliaque postérieure (enfant ou CI à la
ponction sternale)
 Geste :
o Asepsie et analgésie
o Ponction médullaire : prélever un faible volume du suc
médullaire (ne pas provoquer de dilution)
o Réaliser rapidement les étalements de moelle sur lames
(éviter la coagulation du suc médullaire) : 5 à 10 frottis
o Identifier les lames, laisser sécher à l’air libre
o Prélèvement sur EDTA (immunophénotypage, caryotype)
o Surveiller le patient après le geste
 Étalement de bonne qualité du myélogramme :
- Frottis médullaire régulier avec des franges
- Non coagulé , Non dilué
- Présence de grumeaux
- Non réalisé sur la partie dépolie de la lame
• Étalements de moelle défectueux :

Quantité trop Répartition Frottis Pas assez


importante hétérogène médullaire de suc
Pas de franges irrégulier médullaire
 Fiche de demande du myélogramme :
- Identité du patient, âge, ATCDs, indication du myélogramme
- Date et heure
- Site de ponction
- Dureté de l’os
- Degrés de facilité de l’aspiration

 Transport:
- Après séchage complet à l’air libre
- Boîtes porte lames étiquetées
2) Coloration :
 Coloration par MGG classique (idem coloration frottis sanguin)
 Choisir 2 à 3 frottis médullaires pour coloration (étalement
homogène + présence de grumeaux)
 Conservation des lames non colorées pour coloration cytochimique
éventuelle ou nouvelle coloration MGG (jusqu’à 10 ans de
conservation).
Phase pré-analytique en
immunohématologie
I- Renseignements
 Identité
 Âge, sexe
 ATCDs transfusionnels, incidents transfusionnels
 Grossesse en cours, accouchement
 Injection récente d’immunoglobuline anti-D
 Symptomatologie : syndrome hémorragique, syndrome anémique
 Degrés d’urgence
II- Prélèvement

 Ponction veineuse franche


 Garrot peu serré, durée < 1 min
 Prélèvement sur tube EDTA
 Identification : au lit du malade, nom et prénom, date et heure du
prélèvement
 Identification du prescripteur et du service demandeur
 Un tube est nécessaire pour chaque détermination
III- Transport
 Les échantillons doivent être placés dans des contenants afin de
préserver l’intégrité des échantillons
 Le délai maximal d’acheminement est de 24h

IV- Prise en charge au laboratoire


 Rejeter les non-conformités :
- Discordance entre étiquetage du tube et bon d’examen
- Prélèvement coagulé
- Délai d’acheminement > 24 h
Conclusion
 La phase pré-analytique : une des principales sources d’erreurs
 En hématologie biologique :
la phase pré-analytique est le
garant principal de la fiabilité
des résultats

 Maîtrise de la phase pré-


analytique  étroite
collaboration entre les
différents intervenants avant
l’arrivée du tube au
laboratoire
Références
• Ellouze R, Guermazi S. Importance de l’étape préanalytique en hémostase. Ann Biol
Clin 2013 ; 71(4) : 401-7
• Recommandations pré-analytiques en hémostase – GEHT, Révision partielle octobre
2015
• F. Trimoreau et al, Étapes préanalytiques pour la numération et cytologie sanguine,
2011 Elsevier Masson SAS
• Nathalie Lefevre-Bultingaire, Hélène Jouault, Frottis sanguin, EMC, 2002
• Imbert M., El Khoury M. Coloration de May-Grünwald-Giemsa. EMC (Elsevier Masson
SAS, Paris), Encyclopédie Médico-Biologique, 90-15-0035, 2006
• F. Trimoreau et al, Étapes préanalytiques pour la cytologie médullaire, ganglionnaire et
des liquides biologiques, 2011 Elsevier Masson SAS
• Thèse : la phase pré-analytique en hématologie : Étude des non conformités au
Laboratoire central d'Hématologie de l’Hôpital ibn Sina Rabat, Hassan FATTAH, FMPR,
2015
• J-F.Lesesve et al, Le myélogramme - GFHC, Feuillets de biologie / N°342 – Mai 2018