La chromatographie

• Classification des chromatographies

• Grandeurs chromatographiques
– Volume de rétention
– Résolution
– Quantification en chromatographie
• Chromatographie en phase liquide
– Adsorption
– Partage
– Exclusion stérique
– Echange d’ions
• Chromatographie en phase gazeuse
– Adsorption
– Partage
• L’appareillage en chromatographie
Principe de la chromatographie
CHROMATOGRAPHIE
Description
Méthode de séparation de composés fondée sur l’entraînement de ces
composés par une phase mobile, appelée éluant ou solvant ces
composés étant séparés les uns des autres par des interactions plus
ou moins fortes une phase fixe ou stationnaire

Points communs: utilisation d’un support (poudre très fine en grains,

ou solide percé de canalicules  surface importante
la substance à analyser circule dissoute dans un solvant
convenable entre les particules du support ou les microcanalicules
il se crée des interactions physiques entre les particules
du support et la substance à analyser (van der Waals, polaires).
Les liaisons sont rapides et réversibles; elles dépendent de la nature
chimique des substances et donc permettent leur séparation.
Classification
Plusieurs types de classification sont possibles: selon la nature des
phases, selon les mécanismes moléculaires mis en jeu ou selon les
technologies pratiques mises en œuvre. La description d’un procédé
fait appel à toutes ces classifications qui sont complémentaires
CHROMATOGRAPHIE
Mécanismes moléculaires
Ils sont au nombre de 5 selon la nature des forces
Ils sont utilisés séparément ou en association

Adsorption: liaisons hydrogènes ou de Van der Waals

cas particulier des liaisons hydrophobes (phase greffée)

Echange d’ ion: le support est composé de molécules chargées

Si charges + échange d’anions
Si charges -  échange de cations

Filtration en gel: support = tamis moléculaire - billes ou sphères

calibrées de matière poreuse
Grosses molécules exclues du gel

De partage: solvant au moins binaire: eau et toluène ou gaz et liquide

Séparation selon coefficient de partage entre phase
mobile et phase stationnaire

D’affinité: support spécifique - utilise la liaison enzyme-substrat ou Ag-Ac

Introduction chromatographie
Principe
 Séparation de mélange complexe

 Basée sur des équilibres particuliers entre les composés et deux

phases :

 Phase stationnaire

 Phase mobile
 Différentes interactions peuvent entrer en jeu :

 Adsorption
 Partage
 Paires d’ions
 Échange d’ions
 Exclusion stérique
CHROMATOGRAPHIE
Dispositifs

Chromatographie sur colonne en phase liquide

Support de chromatographie
Solvant de dilution de la substance à analyser (stationnaire)
Solvant d’élution (mobile)
Pression variable (basse, moyenne = 10 bars, haute >30 bars)
Analytique, préparative ou gaz-liquide
Chromatographie papier
Feuille de papier filtre placée verticalement en enceinte fermée
imprégnée de vapeur d’eau
Solvant organique ascendant ou descendant
Séparation des substances entre eau et solvant
Révélation des «taches»
Chromatographie couche mince = variante
(couche de support sur verre)

Choix des méthodologies

selon substances et but à atteindre
Introduction chromatographie
Principe
 Affinité forte du produit pour la phase stationnaire :

 Le produit progresse lentement dans la phase stationnaire

 Le temps de rétention du produit est long

 Affinité forte du produit pour la phase mobile:

 Le produit progresse rapidement dans la phase stationnaire

 Le temps de rétention du produit est plus court

 Le temps de rétention du composé permet son identification

Introduction chromatographie
Principe
 Amélioration technique permanente de la chromatographie:

 Miniaturisation et automatisation des systèmes d’injections

 Injection de petit volume

 Répétabilité des injections

 Grande variété de phase stationnaire

 Variation des types d’interactions

 Augmentation de la sensibilité des détecteurs

 Étude de traces
Introduction chromatographie

Principe
-

Colonne
Injection
Détecteur

Phase mobile
Introduction chromatographie
Domaines d’applications
 De nos jours, la chromatographie est la technique de
séparation la plus largement utilisée

 Techniques très répandues dans le monde industriel

 Très grand domaine d’applicabilité

Introduction chromatographie
Domaines d’applications
 Industrie chimique : production, contrôle…

 Industrie alimentaire : corps gras, vins et spiritueux, bière, arôme…

 Industrie cosmétique et parfums

 Industrie pharmaceutique

 Energie : raffinerie de pétrole, gaz naturel, biomasse…

 Contrôle pollution : eaux, sols, atmosphère

 Exploration spatiale

 Police scientifique

 Recherche scientifique
Introduction chromatographie
Les questions que vous aurez à vous poser ?
 Quel type d’échantillon ? Solide, liquide, gazeux
 Que veut on doser ? Composé majeur, mineur ou des traces

 Analyse partielle ou complète de l’échantillon ?

Récupération de l’échantillon ?
 Précision de l’analyse ? Qualitatif ou quantitatif

Durée de l’analyse ?
Quel sera le coût de l’analyse ?
 Poids de l’analyse sur l’environnement ?
 Aspect théorique
Le chromatogramme
-

Colonne
Injection
Détecteur

Phase mobile

Chromatogramme
 Aspect théorique
Le chromatogramme
tR
tM tR’

tM : Temps mort
tR : Temps de rétention
t’ : Temps de rétention réduit
 Aspect théorique
Coefficient de partage

 CS : concentration dans la phase stationnaire

 CM : concentration dans la phase mobile

 Aspect théorique
Grandeurs physiques: Temps
tR
tM tR’

tM (Temps mort) : temps écoulé pour un composé non retenu par la

colonne

tR (Temps de rétention) : temps écoulé entre l’instant de l’injection et

le max du pic du composé
t’R (Temps de rétention réduit) : temps de rétention affranchit des
phénomènes hors phase stationnaire

t’R = tR – tM
 Aspect théorique
Le chromatogramme idéal

Caractéristiques de la courbe de Gauss

 Aspect théorique
Le chromatogramme réel

Cas idéal Surcharge Composé trop peu

de la phase retenu
stationnaire

 Irrégularité de concentration dans la zone de dépôt

 Vitesse de la phase mobile non constante dans la colonne

 Aspect théorique
Grandeurs physiques: Volume
VM (Volume mort) : Volume de la phase mobile

VM = t M . D tM : tps mort
D : Débit
Attention
VM différent du volume de la colonne car il faut
prendre en compte la porosité ε de la colonne
VCol = Volume de la colonne = π . (d/2)2
VM = Volume mort = π . (d/2)2 . ε
ε = 0,8 pour une bonne colonne
 Aspect théorique
Grandeurs physiques : Volume
VM (Volume mort) : Volume de la phase mobile

VM = tM . D tM : tps mort
D : Débit
VS (Volume stationnaire) : Volume de la phase stationnaire

VS = Vtot - VM Vtot : Vol. total interne

VR (Volume rétention) : Volume de la phase mobile qu’il

faut faire passer pour faire migrer le soluté
tR : tps rétention

VR = tR . D D : Débit
 Aspect théorique
Grandeurs physiques : Facteur de rétention k’

 Indépendant du débit

 Indépendant de la longueur de la colonne

 Définit le comportement des colonnes

tR = tM(k’+ 1) k’ = t’R/tM
 Aspect théorique
Règle générale: Facteur de rétention k’
 k’ = 0 → tR = tM ou VR = VM
☻ Composé non retenu par la phase stationnaire
 k’ faible
☻ Composé peu retenu par la phase stationnaire
☻ tR rapide

 k’ très grand
☻ Composé très retenu par la phase stationnaire
☻ tR très grand

 k’ trop grand
☻ Composé trop retenu par la phase stationnaire
☻ Phénomène de diffusion, le pic s’élargit
 Aspect théorique
Règle générale: Facteur de rétention k’
 Ordre de grandeur de k’ : Compris entre 1 et 10

 Le meilleur compromis :

☻Analyse courte
☻Bonne séparation

2 < k’ < 6
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: la théorie des plateaux
 La théorie des plateaux est sans doute la meilleure théorie
permettant d’expliquer les phénomènes de séparation
chromatographique.

 Modélisation des équilibres Soluté/Phase stationnaire/Phase

mobile sous la forme de plateaux.
 Limitations :

 Absence de considération des phénomènes de

diffusion
 Impossibilité d’introduire tout l’échantillon dans un
volume infiniment petit
 Absence de considération cinétique (vitesse
d’échanges entre les deux phases)

Théorie cinétique
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: Efficacité
 Paramètre N : Nombre de plateaux théoriques

 Paramètre H : Hauteur des plateaux théoriques

H = L/N
 N : paramètre relatif, dépend du soluté et des conditions opératoires
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: Efficacité théorique

δ
ω

Dispersion d’un soluté dans la colonne et traduction sur le chromatogramme

ou
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: Efficacité réelle
Pour comparer les performances de différentes colonnes, pour un
même composé, on utilise le nombre de plateaux théoriques
effectifs.

t’R : tps réduit

 Aspect théorique
Grandeurs physiques: Sélectivité α
 La mesure de la sélectivité d’une séparation entre deux
composés est réalisée à l’aide du facteur de sélectivité α
 Le facteur de sélectivité α décrit la position, l’un
par rapport à l’autre, de deux pics adjacents
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: Sélectivité α
 Le facteur de sélectivité α peut être exprimé à
l’aide des paramètres de rétention :
• Avec les temps de rétention :

• Avec les volumes :

α = (VR2 – VM)/(VR1 – VM)

 VR2 = VM + K2VS
 VR1 = VM + K1VS

Or Ki = k’i . VM/VS
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: Résolution R ou Rs
 Le facteur de résolution R permet de traduire numériquement la
qualité de la séparation entre deux pics.

La résolution
 Aspect théorique
Exemple: Résolution R ou Rs

Pour une bonne séparation :

Rs > 1,5
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: Relation entre N et R s
 Pour deux pics homologues :

Or
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: Relation entre R et α s

Or

Approximation : k’ = moyenne de k’1 et k’2 si les pics sont similaires ou

presque
 AspectQuestion
théorique
:
Que faire quand les pics sont mal résolus ?

 On augmente le facteur de rétention k’

On augmente l’efficacité N

On augmente la sélectivité α
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: la théorie cinétique

 La théorie cinétique considère le pic

chromatographique comme représentatif de la
distribution statistique des temps de rétention
des molécules d’une substance donnée sur la
colonne.
La théorie cinétique considère
les phénomènes de diffusion
et de transfert de masse
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: la théorie cinétique
Phénomènes de diffusion:

Diffusion moléculaire longitudinale

Diffusion
turbulente
Remplissage
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: la théorie cinétique
Transfert de masse
 t0, les molécules a et b
a b
d’une même substance
sont sur la même ligne

 ti, a va rester dans le

pore du grain de la phase
stationnaire et b dans la
phase mobile

 tf, b ira plus vite que la

molécule a
 Aspect théorique
Grandeurs physiques: la théorie cinétique
Application à la CPG

Equation de Van Deemter

H = A + B/ū + C.ū
ū = vitesse linéaire moyenne d’écoulement de la phase mobile dans la colonne
Grandeurs chromatographiques
• Hauteur du plateau
h

équivalent
– dépend de la taille
des particules de
phase stationnaire
d d
– Dépend du o

remplissage de la Equation de Vandemter

colonne A: contribution de la diffusion du soluté au
travers de la phase stationnaire

– Dépend du débit (d) B/d: contribution de la diffusion du soluté dans

la phase mobile
de phase mobile Cd: contribution de la résistance au transfert
de masse entre les deux phases

B
h  A   Cd
d
Propriétés des phases stationnaires

• On distingue
– Le support: silice ou alumine
– La phase elle-même
•Adsorbant
•Solide à pores calibrés
•Liquide imprégnant les pores
•Molécules greffées
–Fonction organique
–Échangeur d’ions
Propriétés des supports utilisés en chromatographie
Grain de taille 5 à 10 µm
Classification de la taille des pores:
dp > 50 nm macropore
2< dp < 50 nm mésopore
Dp < 2 nm micropore
Pour les applications en
chromatographie les diamètres des
pores varient entre 10 et 20 nm

La surface spécifique S est majoritairement due à

la surface des pores, elle augmente lorsque la taille
des pores diminue
Vp: c’est le volume des pores: il augmente lorsque
la porosité croit
P: porosité P=100 *Vporeux/Vmatériau
Vo: c’est le volume entre les grains ou volume
Chromatographie en phase liquide
 La chromatographie d’adsorption
Vr  Vo  Vs * Pads
Les phases mobiles utilisées en chromatographie d’adsorption

Solvant Force éluante (silice) Force éluante (alumine)

Hexane 0 0
Ether 0.22 0.28
Chloroforme 0.26 0.40

Chlorure méthylène 0.32 0.42

Acétonitrile 0.50 0.65

Méthanol 0.73 0.95
Eau >0.73 >0.95
 La chromatographie d’adsorption
Vr  Vo  Vs * Pads

• Pads dépend entre autre

–de l’énergie d’adsorption de la
molécule (cette énergie est liée à la
surface occupée par la molécule sur
le site d’adsorption)
–de la polarité de la molécule
–de la nature de la phase mobile
utilisée
 Effet de la taille des pores en chromatographie d’adsorption

• Une diminution de la
taille des pores d=4 nm, S= 900 m2.g-1

augmente la surface
spécifique et par
conséquent le Vr du
d=6 nm, S= 400 m2.g-1
soluté augmente

• Une taille trop faible

des pores peut
d=10 nm, S= 200 m2.g-1
entraîner des
phénomènes
d’exclusion stérique
Effet de la polarité de la phase mobile
en chromatographie d’adsorption

Une augmentation de polarité de la phase mobile diminue Vr

La chromatographie par exclusion stérique
Vo volume intersticiel Vr  Vo  V p * k avec 0  k  1
Vp volume poreux
k coefficient de diffusion du soluté
k=1 diffusion totale
k=0 exclusion totale

Vo Vp Vr
La chromatographie par exclusion stérique
Log M

Vr
R

Vo Vp Vr

Détermination des masses molaires moyennes

 CHROMATOGRAPHIE
D’EXCLUSION
La chromatographie d’exclusion ou de perméation de gel est
fondée sur les rétentions sélectives des molécules de soluté en
fonction de leur taille en raison de leur pénétration dans les pores,
remplies de solvants, d’une phase stationnaire appropriée.
Les grosses molécules exclues de la totalité ou d’une partie
seulement des pores de la phase stationnaire, migrent plus
rapidement que les petites molécules qui peuvent pénétrer dans un
plus grand nombre de pores. La séparation est donc basée sur la
totalité des molécules en solution
 Le volume de rétention VR des molécules x est donné par
l’équation:
VR = Vi + kVp

Vi: volume interstitiel de la colonne ;

Vp: volume des pores de la phase stationnaire ;

k: coefficient de distribution des molécules x.

 Il y a deux cas limites :

♣ K = 0: les molécules considérées sont totalement exclues, en

raison de leur taille, des pores de la phase stationnaire et l’on a:

VR = Vi

Toutes les molécules sortent en même temps de la colonne après

le passage d’un volume de solvant égal au volume interstitiel de la
colonne.

♣ K = 1: Tous les pores de la phase fixe sont accessibles aux

molécules considérées et l’on a:

VR = Vi + kVp = VT

VT est appelé volume de perméation totale.

 En chromatographie d’exclusion, on a l’habitude de porter le
logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume de rétention.
La courbe obtenue présente généralement une partie linéaire. A chaque
valeur du volume de rétention correspond une masse moléculaire.
K=0
107 - Exclusion

106 -
Perméation sélective

105 -
K=1
104 -
Perméation totale
103 -

Vi Vp VR

VT