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Examen cytobactériologique du

liquide céphalo-rachidien (LCR)

Dr Mohammed Nadir HARBAZ

DES-BC 4
PLAN
I. Généralités
II. Prélèvements et transport
III. Déroulement des activités au premier jour
1. Examen macroscopique
2. Analyse biochimique
3. Examen microscopique
4. Mise en évidence d’antigènes solubles
5. Mise en culture
6. Amplification génique
IV. Déroulement des activités au deuxième jour
7. Identification bactérienne
8. Détermination de la sensibilité aux antibiotiques
V. Déroulement des activités au troisième jour
VI. Conclusion
Généralités

Définition
 LCR, liquide biologique transparent dans le quel
 Baignent le cerveau et la moelle épinière

 Contenu dans les méninges entre la pie-mère et l’arachnoïde

Rôles
 La protection mécanique du SNC contre les chocs
 Le maintient de la pression intracrânienne.
 La protection contre les infections
Généralités
Généralités
Indications
• Confirmer un diagnostic de syndrome
méningé
• Reconnaître une cause bactérienne
• Orienter et vérifier l’efficacité d’un traitement
antibiotique
Généralités
Objectifs
• Orienter la thérapeutique dans les minutes qui
suivent le prélèvement grâce à l’examen direct

• Affirmer l’origine bactérienne par la culture et


l’identification des colonies
Généralités
• Déclarer si besoin le cas auprès des autorités
sanitaires pour déclencher l’enquête
épidémiologique ou permettre la prise en
charge des sujet contacts
• Etablir le profil de sensibilité de la souche
incriminée et réévaluer l’antibiothérapie
• Actualiser l’épidémiologie nationale des
méningites bactériennes
Généralités
Etiologie en fonction du contexte clinique
Méningites communautaires

Nouveau-né Enfant de 3 mois Enfant de 2 à 15 Adulte agé


à 2 ans ans, jeune adulte

S. agalactiae S. pneumoniae N. meningitidis S. pneumoniae


E. Coli (K1+++) N. meningitidis S. pneumoniae L. monocytogenes
L. monocytogenes H. influenzae N. meningitidis
Généralités
Etiologies
Méningites neurochirurgicale

S. aureus ,Bactéries corynéformes, S. pneumoniae, Streptococcus


spp, Entérobactéries, P. aeruginosa et apparentés

Méningites de l’immunodéprimé

L. monocytogenes, Entérobactéries, champignons


Prélèvements et transport
Acte médical
• Respect strict des conditions d’asepsie et de
stérilité
• Habituellement par ponction lombaire dans
l’espace L4-L5 ou L5-S1
• Ponction transfontanellaire ou ponction
ventriculaire directe chez le nouveau-né
Prélèvements et transport
 Moment
 avant toute antibiothérapie
 à tout moment
 Nombre : une seule ponction ( 2-3ml)

 Matériel
 Aiguille à PL avec mandarin
 Tampons coton hydrophile stériles
 Antiseptique : alcool iodé

 Trois tubes stériles


DES-BC4 11
Prélèvements et transport
Prélèvements et transport
• Acheminer immédiatement au laboratoire
(dans les 30mn)
• Si examen différé(plus de 30mn), conservation
des échantillons à 37°C pour les cultures, et à
4°C pour les cellules
• LCR recueilli sur 3 tubes à hémolyse stériles
numérotés 1,2 et 3 destinés respectivement
aux analyses biochimique, cytologique et
bactériologique
Prélèvements et transport

sinon il est indispensable de les mettre dans un
milieu de transport trans-isolate « TI »
- envoyer au laboratoire à 37°C ou à la température
ambiante
Prélèvements et transport
 Si le transport excède 48 h, ventiler le flacon avec de
TI au moyen d’une grosse aiguille stérile. L’aiguille ne
doit pas toucher le milieu de culture.
 Au moment de l’envoi enlever l’aiguille et expédier le
TI
Déroulement des activités
au premier jour
Examen macroscopique
Noter le degré de limpidité du LCR et sa
coloration après homogénéisation par une
légère agitation
• Clair « eau de roche »
Normal
Pathologique (méningites virales,
tuberculeuses, mycosique…)
Examen macroscopique
• Trouble ou purulent «eau de riz»
Réaction leucocytaire marquée
Généralement méningite bactérienne
• Hémorragique ou xanthochromique
Dans les 3 tubes évoque plutôt une
hémorragie méningée
Possibilité méningite
Examen macroscopique
• En cas de piqûre d’un vaisseau
LCR est rouge plus marqué dans le 1er
tube que dans le dernier
Avec souvent formation d’un petit caillot
Analyse biochimique
Deux paramètres souvent dosés
• Glycorachie
 normale 0,4g/l (2/3 de la glycémie)
 Hypoglycorachie (< 40 % glycémie) dans les méningites
bactériennes, parfois ourliennes, à Entérovirus
• Protéinorachie
 normale 0,10-0,45g/l
 Hyperprotéinorachie (1 à 5g/l) dans les méningites
purulentes
Analyse biochimique
Autres paramètres
• Chlorurachie
Normale 110-120 mEq/l
Hypochlorurachie si méningite tuberculeuse
• Interféron α
Normale < 2UI/l
Valeurs élevées dans l’atteinte virale
Examen microscopique
LCR total
• Numération des éléments par comptage à la
cellule (Nageotte, Malassez,Kova) après
agitation douce
Evaluer les éléments nucléés et les
hématies par mm³
Normal <5 éléments/ mm³ en dehors
période néonatale(<50 /mm³)
• Centrifugation
Examen microscopique
A partir du culot
• Formule leucocytaire
Coloration au Bleu de méthylène
MGG
• Mise en évidence des germes
Coloration de Gram
Ziehl-Neelsen, encre de Chine…
Examen microscopique
Confrontation des données cytologiques et
biochimiques du LCR oriente vers différentes
hypothèses diagnostiques

Polynucléaire neutrophile Lymphocyte


Examen microscopique
LCR avec prédominance de polynucléaires
• >10 éléments nuclées/mm³ (Polynucléaires >
50%)
• Hyperprotéinorachie
• Hypoglycorachie
Généralement LCR méningite bactérienne non
traitée montre plus 1000 GB/mm³ (PN > 80%)
Examen microscopique
LCR avec prédominance lymphocytaire
• >10 éléments nuclées/mm³ (lymphocytes > 50 %)
• Hyperprotéinorachie
 Si hypoglycorachie
Méningite bactérienne en général L. monocytogenes ou
BK si hypochlorurorachie
Si normoglycorachie
Méningite virale à confirmer par dosage interféron α
et/ou par amplification génique
Examen microscopique
LCR panaché
• >10 éléments nuclées/mm³
• Polynucléaires = lymphocytes (50%)
• Protéinorachie normale
• Glycorachie normale
Hypothèses possibles: listériose, méningite purulente
ou lymphocytaire à son début
Examen microscopique
Examen microscopique
N. meningitidis : Diplocoques Gram négatif parfois

intracellulaires
Examen microscopique
H. influenzae: Bacilles Gram négatif

souvent polymorphes
Examen microscopique
S. pneumoniae: Diplocoques Gram positif
Mise en évidence d’antigènes solubles

Recherche dans le surnageant


• Chauffage du surnageant dans un bain-marie à
100°C pendant 5mn
• Technique d’agglutination de particules de latex
sensibilisées (Slidex ou Pastorex Meningite kit...)
• Intérêts: Rapides, sensibles et spécifiques
• Streptocoques groupe B (S. agalactiae),
N. meningitidis (A, B, C, Y, W135), E. coli K1,

H. influenzae b, S. pneumoniae
Mise en évidence d’antigènes solubles

Pastorex Meningite kit


Mise en évidence d’antigènes solubles

Intérêts:
- Diagnostic rapide: confirmation et caractérisation des
Ag spécifiques de groupe pour N.m, confirmation des
Strep. Pneumoniae, H. influenzae
- Méningites décapitées
- Culture négative
Mise en évidence d’antigènes solubles

Méthode générale
- Préparation de l’échantillon à tester
Chauffer le LCR : BM bouillant, 5min
Centrifuger le LCR: 1000trs/min, 10min
Recueillir le surnageant dans un tube stérile
- Préparation des réactifs
Mise à température ambiante des réactifs: coffret
ouvert; sur la paillasse 30min avant le début du test
Mise en évidence d’antigènes solubles

Méthode générale
- Réalisation du test
Bien homogénéiser les suspensions de particules de latex
Déposer 1 goutte de chacune des susp dans les cercles de carte
jetable ou lame
Déposer 1 goutte de LCR à côté de la goutte de chaque
suspension
Mélanger les 2 gouttes au moyen d’un bâtonnet (fourni dans
coffret)
Agiter légèrement la carte/lame
Mise en évidence d’antigènes solubles

Méthode générale
- Lecture
Lire avec un bon éclairage; au bout de 2 à 10min
Réaction négative: la suspension reste homogène
Réaction positive: apparition d’une agglutination ±
franche
Mise en culture
Systématique pour tout LCR
• GSO, GSC supplémentées en facteurs de croissance
et incubées à 37°C sous 5 à 10% de CO2
• BCC incubé à 37°C
• Schaedler incubé à 37°C en anaérobiose
• Ces milieux sont observés après 18 h et 48 h et
conservés 5 jours
Mise en culture
Milieux additionnels selon les circonstances
• Gélose Sabouraud sans actidione dans la
méningite lymphocytaire chez un immunodéprimé
(SIDA)
• Milieu Lowenstein-Jensen ou Coletsos et milieux
liquides dans la méningite tuberculeuse
Amplification génique
Recherche de gènes spécifiques par amplification
génique (PCR)
• Indications
 Examen direct et recherche antigènes solubles négatifs
associés à des signes cliniques ou biologiques de méningite
 Méningite décapitée par antibiothérapie
• PCR à réaliser selon contexte
 PCR N. meningiditis
 PCR S. pneumoniae
 PCR H.influenzae, Bk etc
Déroulement des activités
au deuxième jour
Identification bactérienne
• Identification complète de la souche
• Détermination du sérogroupe ou du sérotype
(N. meningitidis, H. influenzae , S. pneumoniae
et L. monocytogenes)
• Envoi de la souche isolée au centre de
référence correspondant
Identification bactérienne
Colonies translucides de H. influenzae sur GSO
Identification bactérienne
S. pneumoniae avec hémolyse alpha
Identification bactérienne
Colonies lisses et translucides de
N. meningitidis sur GSC
Détermination de la sensibilité
aux antibiotiques
• Détermination du profil de sensibilité aux
antibiotiques par antibiogramme standard
• Antibiotiques testés selon leur activité sur la
souche isolée
Déroulement des activités

au troisième jour
Lecture et interprétation des
résultats
• Tenir compte de toutes les étapes depuis
l’examen macroscopique jusqu’à
l’antibiogramme
• Validation biologique et rendre les résultats
Conclusion
Examen du LCR
• Urgence bactériologique qui nécessite un
traitement du prélèvement dans les plus brefs
délais
• Collaboration entre biologiste et médecin
• Rendre des résultats au clinicien en temps réel
MERCI DE VOTRE ATTENTION