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Coproculture

Dr Souleymane THIAM
DES-BIO 4

1
Objectifs
1. Définir la coproculture
2. Décrire les conditions de prélèvement
3. Décrire la démarche diagnostic pour
l’isolement des agents pathogènes
4. Citer les principales bactéries recherchées

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I. Généralités

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I.1 Définitions
 Les selles
 Produits polymicrobiens
 Ensemencement sur milieux de culture appropriés

 Coproculture
 Culture bactériologique de selles qui, via une
coproscopie, décèle la présence de germes
pathogènes normalement absents du tube digestif
ou anormalement nombreux.

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I.2 Intérêt
 Diagnostic
 Diarrhée infectieuse bactérienne ?
 TIAC
 Dysmicrobisme (post-antibiothérapie)
 Thérapeutique (prophylactique)
 Sujets à risque ( immunodéprimé, en
réanimation)
 Contexte réglementaire (cuisiniers, vendeurs)
 Enquête épidémiologique

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I.3 Rappels
Diarrhée : émission d’au moins 3 selles/j de
consistance anormale (OMS)
 Aiguë < 14 j

 Persistante > 14j

 Chronique > 4 semaines

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I.3 Rappels
TIAC (Toxi-Infection Alimentaire Collective)
 Survenue d’au moins 2 cas
 De symptomatologie (en générale digestive)
 Dont on peut rapporter la cause à une même origine
alimentaire.
 Rôle de l’alimentation:
 Passif: simple vecteur de l’agent pathogène
 Actif: siège de la multiplication ± production de
toxine

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I.3 Rappels
Flore intestinale normale:

 Essentiellement colique

 Estomac: très peu de bactéries

 Intestin grêle < 10 5/g (transit rapide, péristaltisme


important)

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I.3 Rappels
Flore intestinale normale:
 Flore colique: 5. 10 10 à 2.1011 bactéries/g de selles
 Flore résidente dominante
 Germes anaérobies stricts: +++ 109 A 1010 germes/g.
ex: Bacteroides, Clostridium.
 Flore résidente sous-dominante:
 Espèces aéro-anaérobies facultatives( 1% de la flore )
ex: entérobactéries (E. coli, Klebsiella, Enterobacter)
 Bactéries lactiques aéro-anaérobies facultatives ex:
Lactobacillus
 Flore de transit
 Variable selon individus, alimentation ex: S. aureus,
Proteus, Pseudomonas, levures…
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Agents entéropathogènes souvent
isolés

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I.4 physiopathologies
Germes toxinogènes
 Sécrétion d’eau et d’électrolytes par les cellules
épithéliales du grêle (proximale) sans lésion de
l’épithélium
 SC: syndrome cholérique
 Agents pathogène
 Vibrio cholerae: selles liquides profuses « eau de
riz » sans fièvre
 Toxine thermolabile des ECET et certains par aug
de l’AMPc et thermostable de E. coli par aug du
GMPc

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I.4 physiopathologies
Germes entéro-invasifs
 Envahissement et destruction des cellules
épithéliales après multiplication
 SC:
 Selles afécales glaireuses sanglantes
 Syndrome dysentérique (épreintes, ténesmes,
fièvre, douleurs du cadre colique…)
 Agent pathogène
 Shigella…

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I.4 physiopathologies
Germes mixtes: entéro-invasifs et
toxinogènes
 Envahissement et traversée de l’entérocytes
sans destruction avec une multiplication dans
la sous muqueuse (grêle+++)
 SC: syndrome gastroentérique
 Agent pathogène
 salmonella (risque de diffusion systémique chez les
drépanocytaire et les immunodéprimé: S typhi)

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II. Prélèvement

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II.1 Recueil des selles
 Condition du recueil
 Avant toute antibiothérapie
 A tout moment de la journée et de la nuit
 Selles fraîchement émises (+++)

 Matériels
 Pot stérile à large ouverture avec cuillère
fixée sur le couvercle
 Ecouvillons stériles en coton

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II.1 Recueil des selles
 Matériels

Ecouvillons stériles

Pot stérile Papier Buvard

Gélose Cary Blair

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II.1 Recueil des selles
 Technique du recueil
 Défécation dans un pot stérile
 Recueil qq g de selles fraîches grâce à une
spatule dans pot stérile
 Choisir échantillon muco-purulent ou sanglant
s’il y’en a.
 Ecouvillonnage rectale: nouveau-né, nourrisson,
personnes âgés

 Recueil selles sur papier buvard chez cholérique

NB : ne pas prélever selles émises dans cuvette des17


WC
II.2 Transport
Acheminement rapide au laboratoire

 Si longue distance et ou long délai : gélose de Cary


Blair , EPHA

 Selles liquides (5 à 10 gouttes ) sur papier buvard,


sécher, adresser au Laboratoire sous enveloppe

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II.3 Conservation

 Salle climatisée : délai 1H sur paillasse

 Réfrigérateur à +4°C : délai de 12H

 papier buvard : délai de 48 H

 Gélose de Cary Blair : délai de 72 H

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II.4 Réception au laboratoire
 Identité du malade
 Renseignements cliniques: Médecin ou patient
 Âge, Origine géographique ou voyage récent
 Antibiothérapie, Cas de diarrhée dans l'entourage
 Signes cliniques : fièvre?, douleurs?,
vomissements?
 Données d’hospitalisation ( pavillon, n° du lit, n° du
dossier ,Date …)
 Prescripteur de l’analyse
 Heure du prélèvement (+++)

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III. Diagnostic au
laboratoire

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III.1 Le premier jour
Examen macroscopique
Oriente sur la physiopathologie de la diarrhée
 Selles normales :moulées, fermes ou molles

 Aspect :
 purulent, présence de mucus, présence de sang.

 Consistance selles pathologiques :


 Selles liquides, ocres : typhoïde
 Selles afécales «eau de riz»: choléra
 Selles glaireuses, sanguinolentes : dysenterie,
amibiase…
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III.1 Le premier jour
Examen microscopique
État frais
 Densité et mobilité flore bactérienne
(Campylobacter , Vibrio…)
 Recherche leucocytes
 En cas de diarrhées à germes invasifs : présence
de leucocytes (Salmonella spp, Shigella spp,
Campylobacter spp.)
 Présence de leucocytes inconstante
 En cas de diarrhées à germes entérotoxigéniques :
pas de leucocytes( Vibrio cholerae , C. difficile…)
 Recherche d’hématies
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III.1 Le premier jour
Examen microscopique
Coloration de Gram
 Flore normale: majorité BGN avec qqs BGP
 Apprécier déséquilibre flore

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III.1 Le premier jour
Examen microscopique
Coloration de Gram

Vibrio cholerae Campylobacter jejuni

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III.1 Le premier jour
Examen microscopique
Coloration de Gram

Clostridium difficile S. aureus


III.1 Le premier jour
Ensemencement
 Géloses sélectives pour l’isolement des bactéries
 Salmonelle – Shigelle : SS
 Hektoen : HK
 Xylose Lysine Décarboxylase : XLD
 Eosin Methylen Blue : EMB
 Thiosulfate Citrate Bile Saccharose : TCBS
 Bouillons d’enrichissement
 Bouillon au Sélénite de sodium (BS) pour Salmonella
 Eau Peptonée Hyper Alcaline (EPHA) pour Vibrio
cholerae
 Incubation milieux
 37°C, en atmosphère aérobie : HK, SS,TCBS, EMB, BS,
EPHA 27
III.1 Le premier jour
Ensemencement
Choix des milieux à ensemencer en fonction de l’âge

 Tout âge :
 Gélose SS ;Gélose HK ;Gélose XLD ; Gélose TCBS
 Bouillon BS ; Bouillon EPHA

 Enfant âgé de 0 à 3 ans :


 Compléter en plus avec une gélose EMB

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III.2 Chronologie de la
coproculture
1. Recherche de Salmonella - Shigella : jour 0
 Ensemencement de milieux sélectif d'isolement
lactosé
 Gélose SS
 Contient 3 inhibiteurs (sels biliaires, vert
brillant et citrate de sodium), inhibant Gram +
et ralentissant croissance autres Gram –

 Milieu électif : Bouillon sélénite (3-6 h


d’incubation à 37˚C ) puis repiquage sur milieu SS
puis incubation à 37˚C pdt 24 à 48 h

29
III.2 Chronologie de la
coproculture
1. Recherche de Salmonella - Shigella : jour 0
 Ensemencement de milieux sélectif d'isolement
lactosé
 Gélose Hektoen
 étude de 3 sucres ( lactose, saccharose,
salicine) et H2S et incubation à 37˚C pdt 24 h

 Gélose sélective XLD:


 Bon milieu sélectif, en particulier, pour
l'isolement des Shigella
 Incubation à 37˚C pdt 24 h
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III.2 Chronologie de la
coproculture
1. Recherche de Salmonella - Shigella : jour 1

 Gélose SS
 Lecture fermentation lactose (colonies rouges) et
production H2S (centre noir)

 Colonies suspectes salmonelles = incolore +/-


centre noir

 Colonies suspectes shigelles = colonies de même


couleur que Salmonella mais sans centre noir
(H2S-) 31
Gélose avant
ensemencement

Colonies de même couleur


Salmonella: Colonies incolore ± que Salmonella mais sans
centre noir centre noir (H2S-)
III.2 Chronologie de la
coproculture
1. Recherche de Salmonella - Shigella : jour 1

 Gélose Hektoen:
 Non utilisation lactose, saccharose et salicine:
colonies vertes

 Production ou non d’H2S: colonies à centre noir

 Colonies suspectes = colonies vertes avec ou sans


centre noir

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Gélose avant utilisation

Salmonella

Shigella
III.2 Chronologie de la
coproculture
1. Recherche de Salmonella - Shigella : jour 1
 Gélose sélective XLD:
 Colonies suspectes Salmonella = colonies rouges
,SH2 +, révélé par la couleur noire au centre de la
colonie
 Colonies suspectes Shigella = colonies rouges sans
SH2,

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III.2 Chronologie de la
coproculture
1. Recherche de Salmonella - Shigella : jour 1

 Test à l’Uréase
 Choix de 5 colonies suspectes avec ou sans centre
noir et ensemencement dans de l’ Urée-Indole /
incubation pdt 4h à 37˚C

 Si Uréase négatif faire ensemencement de deux


milieux Kliegler Hajna et mannitol mobilité puis
incubation à 37˚C pdt 24 h

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III.2 Chronologie de la
coproculture
1. Recherche de Salmonella - Shigella : jour 2
 Lecture de la mini galerie : KH et MM
 Salmonella
 Glu (+) ,U (-), I (-), L (-), SH2 (+/-) , gaz (+/-)
Mannitol (+) , Mobilite (+) agglutination avec
sérums anti Salmonella
 Shigella
 Glu (+) ,U (-), I (-/+), L (-), SH2 (-),gaz(-) ,Mannitol
(+) , Mobilite (-) agglutination avec sérums anti
Shigella
 Si agglutination positive
 Réisolement sur gélose nutritive (pureté)
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III.2 Chronologie de la
coproculture
1. Recherche de Salmonella - Shigella : jour 3
Antibiogramme

Salmonella typhi Shigella 38


III.2 Chronologie de la
coproculture
2. Recherche de Vibrio cholerae
 Jour 0
 Ensemencement milieu TCBS puis incubation 18 à
24 h à 37˚C
 Repiquage sur TCBS après enrichissement sur EPHA
incubé 3-6 h à 37˚C
 Jour 1
 Sur TCBS colonies suspectes de Vibrion (sac +, et
H2S -) : Grosses jaunes ou vertes
 Tester l’oxydase
 Ensemencer galerie : KH, UI, CS, MM,MH

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III.2 Chronologie de la
coproculture
2. Recherche de Vibrio cholerae: Jour 1
III.2 Chronologie de la
coproculture
2. Recherche de Vibrio cholerae: Jour 2
 Lecture galeries (KH, UI, CS, MM)
 Vibrio cholerae:
 Glu (+) ,L (-), SH2 (-), U (-), I (+), Saccharose
(+) ,Gaz (-) , MM (+) , M(+), CS(+), oxydase (+),
ONPG (+)
 VPH: L (-), ONPG (-), SH2 (-), U (-), I (-),
saccharose (-)
 Si Vibrion cholérique identifiée, alors agglutination
avec antisérum spécifique (sérums polyvalents anti
Vibrio O1 et O139 )
 Réisolement sur gélose
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III.2 Chronologie de la
coproculture
2. Recherche de Vibrio cholerae: Jour 3
Antibiogramme

 L'antibiogramme devra inclure les antibiotiques


suivants : amoxicilline, tétracycline, sulfamides, co-
trimoxazole.

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III.2 Chronologie de la
coproculture
Recherche de Escherichia coli : Enfants de moins de 3
ans
 Jour 0
 Milieu Eosine-Bleu de Méthylène ( EMB)
 Milieu contenant du lactose, incubation pdt 24 h à
37˚C
 Jour 1
 Colonies suspectes / lactose - : colonies à « reflet
métallique » (violet)
 Faire tests biochimiques : ensemencer mini galerie
: KH, UI, CS

43
III.2 Chronologie de la
coproculture
Recherche de Escherichia coli

44
III.2 Chronologie de la
coproculture
Recherche de Escherichia coli : Enfants de moins de 3
ans
 Jour 2

 E. coli: Glu(+), L(+), SH2(-), Gaz(+), Mob(+),


ONPG(+), I(+), U(-), VP(-), TDA(-)

 Si caractères de E. coli
 Agglutination avec les antisérums EPEC
 Si positif, Réisolement sur gélose nutritive
(pureté)
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III.2 Chronologie de la
coproculture
Recherche de Escherichia coli : Enfants de moins de 3
ans: Jour 3 Antibiogramme

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III.2 Chronologie de la
coproculture
 Antibiogramme

 Impératif pour Salmonella, Shigella, Escherichia


coli et pour Vibrion cholérique en milieu
endémique (prophylaxie par les sulfamides)

 Souche testée par méthode des disques sur milieu


de Mueller Hinton à 37°C en atmosphère ambiante
pendant 24 h

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48
49
III.3 Recherche de virus des
gastroentérites
Enfants de moins de 5 ans

 Virus recherchés : Rotavirus, Adénovirus

 Centrifuger 1-2 grammes de selles

 Recueillir le surnageant

 Réaliser un test d’agglutination sur lame ou carte

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III.3 Recherche de virus des
gastroentérites
Tests aux particules de latex

 Principe : particules sensibilisées avec des


antisérums spécifiques
 « latex rotavirus » sensibilité de 85 % et
spécificité de 95 %
 « latex adénovirus » : faible sensibilité de 36 à 86
%, spécificité entre 96 et 100 %.

 Avantages : utilisable par tous


 laboratoires, coût raisonnable, mais nécessité
contrôles de spécificité. 51
III.3 Recherche de virus des
gastroentérites
Tests aux particules de latex

52
III.3 Recherche de virus des
gastroentérites
Recherche des antigènes : Rotavirus

 Directement à partir des selles.

 Matériel nécessaire disponible dans tous les


laboratoires de diagnostic virologique.

 Permet la recherche sur de nombreux échantillons.

 Méthodes sensibles
53
III.3 Recherche de virus des
gastroentérites

54
III.4 Cas particulier
Recherche Yersinia enterocolitica
 Milieu CIN (Cefsulodine-Irgasan-Novobiocine) peu sélectif à 48-72h,
 24 h petites colonies à centre rouge entourées d’une
zone translucide
 48 h, Colonies rouges : mannitol +
 Colonies jaunes : mannitol –
 Identification: Yersinia: +++ galerie

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III.4 Cas particulier
Recherche Campylobacter: 1er jour
 Ensemencer une gélose Columbia au sang frais
sélective (mélange de 3 AB)
 Incuber pendant 48H, à 42°C, en atmosphère micro
aérophile
 Lecture à part

Milieu: Karmali
Gélose de base Columbia
Charbon activé ,Hémine
Supplément sélectif: pyruvate de
sodium,vancomycine, céfopérazone,
cycloheximide J2 à J5
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III.4 Cas particulier
Recherche Campylobacter: 2ème jour
 Choisir 5 colonies plates, grisâtres
 Réaliser
 Etat frais : rechercher une mobilité polaire
 Coloration de Gram : bacille en forme de «S»
 Rechercher la catalase et l’oxydase : elles sont (+)
 Ensemencer chaque colonie suspecte sur une galerie :
KH, UI, MH

Recherche Campylobacter: 3ème jour


 Lire et interpréter la galerie
 Réaliser un antibiogramme 57
III.4 Cas particulier
Recherche de Clostridium difficile

 Recherche des toxines par immunoenzymologie

 Isolement sur gélose au sang de mouton additionnée


d’un cocktail d’antibiotiques (Amphotéricine B,
Cyclosérine, Céfoxitine) en incubation anaérobie

 Puis identification des colonies suspectes (odeur de


crottin de cheval…) par une galerie biochimique

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III.4 Cas particulier
Recherche de Clostridium difficile

Gélose au sang Milieu à l’Esculine

59
III.4 Cas particulier
Recherche de Clostridium difficile
 Recherche des toxines par immunoenzymologie: Selles

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IV. Résultats et
interprétation

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IV.1 Présence de bactéries
entéropathogènes spécifiques

 Infection en cours: si le germe pousse en


abondance sur la gélose d’isolement

 Portage possible: si le germe est isolé


uniquement après enrichissement

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IV.2 Absence de bactéries
entéropathogènes spécifiques
 Infection peut être au début (peu de germes dans
les selles)

 Prélèvement de mauvaise qualité (recueil,


transport, conservation)

 Malade sous antibiotique

 Diarrhée peut être d’origine virale ou parasitaire

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IV.3 Validation – Saisie –
Délivrance des résultats

 Délai : 3-4 jours

 Il ne faut pas répondre « Coproculture


négative »

 Lister les germes entéropathogènes


recherchés

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Algorithme décisionnel

 Délai : 3-4 jours


 Il ne faut pas répondre « Coproculture
négative »
 Mais il faut dresser la liste des germes
entéropathogènes recherchés

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Conclusion
 Nécessite un laboratoire de bactériologie bien équipé,
disposant de tout le matériel pour réaliser de bonnes
cultures et surtout d'un personnel qulalifié
 Ne peut être effectuée dans tous les cas de diarrhée, mais
elle a un intérêt épidémiologique important et indispensable
en santé publique
 La présence des bactéries pathogènes dans les selles
n’implique pas forcement une maladie.
 Une recherche négative n’implique pas forcement leur
l’absence
 Le biologiste ne doit pas répondre « pas de bactéries
entéropathogènes » mais doit donner la liste des bactéries
effectivement rechérchées .

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Références
• http://www.memobio.fr/html/bact/ba_pr_cop.html
• http://
www.infectiologie.com/UserFiles/File/medias/JNI/JNI11/IDE/JNI2011-copro-bisson.pdf
• HADDAR, C., BEGAUD, E., MASLIN, J., et al. Résumé Dans le monde, environ 140 millions de
personnes souffrent de shigellose chaque année. L’identification traditionnelle de Shigella spp. lors
de la coproculture manque de sensibilité (Se). Un diagnostic rapide permet de prescrire un
traitement antimicrobien approprié qui raccourcit la durée et la gravité de la maladie, et réduit le
risque de propagation de l’infection dans une communauté. L’Institut.. Bulletin de la Société de
pathologie exotique, 2017, vol. 110, no 1, p. 80-84.
• THIERRY, J., AMOUR, S., DEL SIGNORE, C., et al. Détection de Campylobacters spp et Salmonella spp
chez l’Homme: analyse descriptive chez des patients se rendant dans des laboratoires d’analyses
médicales entre 2012 et 2016. Médecine et Maladies Infectieuses, 2018, vol. 48, no 4, p. S78.
• LOUIS, Frantz Jean, BUTEAU, Josiane, BONCY, Jacques, et al.Building and Rebuilding: The National
Public Health Laboratory Systems and Services Before and After the Earthquake and Cholera
Epidemic, Haiti, 2009–2015. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 2017, vol. 97,
no 4_Suppl, p. 21-27.
• BERTHÉLÉMY, Stéphane. La coproculture ou l’examen bactériologique des selles. Actualités
Pharmaceutiques, 2016, vol. 55, no 557, p. 59-61.

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