02 Introduction : Nos connaissances actuelles sur les événements biologiques qui se produisent dans les cellules des organismes vivants peut être attribuée à l'existence de beaucoup techniques de laboratoire utilisées dans l'étude de ces processus Parmi ces techniques est la technique « Northern blot» est très utile dans l'analyse de l ARN La plupart des informations disponibles qui sont connaissons aujourd'hui sur l'expression des gènes et les fonctions d'ARN peuvent être attribués à cette technique .
03 Définition : Une méthode de laboratoire utilisée pour détecter spécifiquement des molécules d'ARN spécifiques au sein d'un mélange d'ARN Northern bot peut être utilisé pour analyser un échantillon d'ARN à partir d'un tissu ou un type particulier de cellule a fin de mesurer l'expression de gènes d'ARN spécifiques .
04 Utilisation:
L'étude directe de l'expression de gènes au niveau de l'ARN
Détection de la taille de transcription ARN Étudier la dégradation des ARN Étudier épissage de l'ARN peut détecter des transcrits d'épissage alternatif Étude la demi-vie de ARN IRES étude(site d'entrée interne des ribosomes)pour supprimer la possibilité de la digestion d'ARN Souvent utilisé pour confirmer et de vérifier transgéniques 05 Principe
Séparation des ARN sur gel par électrophorèse
Transfert des ARN sur membrane ( capillarité ) Hybridation de la membrane avec une sonde spécifique du gène d'intérêt Protocol: La première étape d'un Northern blot consiste à dénaturer ou séparer l'ARN dans l'échantillon en brins simples, ce qui garantit que les brins sont dépliés et qu'il n'y a pas de liaison entre les brins. Les molécules d'ARN sont ensuite séparées selon leur taille en utilisant électrophorèse sur gel Après la séparation, l'ARN est transféré du gel sur une membrane de transfert. Une fois le transfert terminé, la membrane de transfert porte toutes les bandes d'ARN à l'origine sur le gel. Ensuite, la membrane est traitée avec un petit morceau d'ADN ou d'ARN appelé sonde, qui a été conçu pour avoir une séquence complémentaire d'une séquence d'ARN particulière dans l'échantillon; cela permet à la sonde de s'hybrider ou de se lier à un fragment d'ARN spécifique sur la membrane De plus, la sonde a un marqueur, qui est généralement un atome radioactif ou un colorant fluorescent. Ainsi, après l'hybridation, la sonde permet de détecter la molécule d'ARN d'intérêt parmi les nombreuses molécules d'ARN différentes sur la membrane Botrytis cineria: est un champignon pathogène qui est responsable de la poitrine grise maladie cryptogamique ; et de la poitrine noble Les étapes de technique northern blot Les ARN totaux extraits a partir des feuilles détachées de tomate Séparation par électrophorèse d’agarose dénaturant les ARN sont transfères sur un membrane de nylon La membrane est récupérée et puis hybridée avec des sondes marques Puis exposition a un film autoradiographie 11 12 13 Les Inconvénients: La dégradation de l'échantillon par ARNase qui peuvent être par une bonne stérilisation de la verrerie et l'utilisation des inhibiteurs de Rnase comme DEPC ( diethylpyrocarbonate )
Les produit chimique utilisé dans la plupart des taches du Northern blot peut être un risque pour le chercheur, comme leformaldéhyde,le matières radioactives,le bromure dethidium,et la lumière UV sont tous nuisibles dans certaines exposition
07 Les avantages La détection de la taille ARN L'observation des produits d'épissage alternatifs d ARN L'utilisation de sondes ayant une homologie partielle La qualité et la quantité d ARN peut être mesuré sur le gel avant le tampon et les membranes peuvent être stockées avec sonde pendant des années L explication des marqueurs tumoraux spécifique par hybridation ARN – ADN
11 Conclusion :
Northern blot, même si une technique relativement ancienne est
encore aujourd'hui utile dans l'étude et l'analyse de lARN Cette situation est attribuable à sa flexibilité, simplicité La technique sest avérée utile et indispensable dans l'étude e l'analyse de olécules dARN dans les cellules des organismes; application de cette technique dans lARN lié demandes de renseignements devrait se poursuivre dans plusieurs décennies a venir
