UNIVERSITE MOHAMMED PREMIER

FACULTE DES SCIENCES

OUJDA

Régénération des
plantes à partir de la
fusion des protoplastes

Master : Ingénierie Horticole et Paysagère, année universitaire 2020/2021

Plan
• Introduction
• Matériel et méthode
• Résultat et discussion
Matériel et méthode
 Matériels Méthodes
Apex de tige de Passiflora edulis Méthodologie de Feulgen
var. Flavicarpa
Des explants des feuilles Repiquage
Des mélange d'enzymes électrophorèse sur gel de
polyacrylamide
Tissu de cals
Polyéthylène glycol (PEG)
Gouttelettes d'agarose en milieu
KM8P
Fluorure de phénylméthylsulfonie
(PMSF)
Hydroxyquinoléine
L'éthanol
carmin acétique
L’acide acétique
Isolement des protoplastes de tissus foliaire

l'apex de la tige de Passiflora edulis var. Flavicarpa.

les protoplastes isolées de tissus foliaire par utilisation d’un
mélange d’enzyme: 2% de cellulase RI0 et 0,4% de
macérozyme R10 diluée dans une solution de CPW 13
additionnée de 5 mM de MES, pH 5,8
Isolement des protoplastes à partir d’une
culture de suspension cellulaire:
P.alata Ait - P.amethystina Mikan -
P.cincinnata Mast - P.coccinea Aubl et
P.giberti
• Obtenus à partir d’explants de feuilles cultivées
pendant 28 jours dans le milieu MD ( Agha et
Mourad Dexheimer 1979 ) à l’obscurité.
• Flacons Edenmeyer de 125 ml: transfert d’un
gramme de tissus de cal dans 25ml de milieu MD
 les flacons ont été scellé avec une feuillage d’aluminium et
maintenue sous agitation (130 Tr/min) à une température de
25 + où – 2°c à l’obscurité.
 Par transfert à un milieu MD liquide frais, les repiquages ont été
effectués dans une intervalles de 7 jours
 Après 3 jours, les protoplastes ont été isolé par l’utilisation d’un
mélange d’enzyme [ 2% de pectolyase Y-23 et 1% de
cellulysine (Calbiochem) diluée dans Solution CPW 13]
Fusion de protoplastes:
 Les protoplastes de Passiflora edulis var. flavicarpa et
les autres espèces ont été remis en suspension à une
densité de 2 x105 protoplastes / ml de CPW 13 à un
rapport de 1:1
 Réalisation d’une fusion chimique par utilisation de
polyéthylène glycol (PEG)
 Le pourcentage d'hétérodimères a été calculé par
rapport au nombre de protoplastes ayant subi une
fusion
 Trois expériences de fusion indépendantes avec au
moins 4 réplicats, chacune ont été réalisées pour
toutes les combinaisons des espèces de P. edulis-
sauvages
Culture et régénération des produits de fusion

 Les produits des expériences de fusion ont été cultivés en

gouttelettes d'agarose en milieu KM8P sans sélection
 Le milieu liquide de bain a été remplacé tous les 7 jours par
un mélange (1/1) de milieux KMSP et KM8
 Les colonies ont été transférées dans un milieu MD solide
(0,6% d'agarose) et maintenues à l'obscurité pendant 56
jours
 Les cals hybrides somatiques putatifs ont été sélectionnés
par leur modèle élétrophorétique des protéines solubles et
des isoenzymes avant l'induction de la régénération des
plantes
 Des cals d'environ 1 mm de diamètre ont été transférés dans
un milieu basal MS solide (0,15% Phytagel) (Murashige et
Skoog 1962) supplémenté avec 3% de saccharose, 2 mg/l
BAP et 10% d’eau de coco, à 23 µEm-2s-1 de rayonnement
lumineux pour la régénération des pousses
 Des pousses de 1 à 2 cm de long ont été excisées et
repiquées tous les 28 jours sur phytagel solidifié au milieu de
base MS semi solidifier, sans hormones jusqu'à ce que les
racines se développent.
 Les plantes ont été transférées dans des conditions de serre
pour être acclimatées.
Analyse des protéines solubles et des isoenzymes:

 Des échantillons de cals provenant d'hybrides putatifs ont

été collectés, congelés à -18 ° C et macérés dans 0,1 mM
de fluorure de phénylméthylsulfonie (PMSF)
 Les extraits de protéines ont été séparés par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide
 Les gels ont été colorés avec 0,05% de bleu de Coomassie
R-250 dans de l'acide acétique-méthanol-eau (1/4/8)
 Après 24 h de culture, des échantillons des gouttelettes
d'agarose ont été prélevés de manière aseptique des boîtes de
Pétri, fixés dans de l'éthanol-acide acétique (3/1) colorés au
carmin acétique (2%) et placés sur des lames pour compté le
nombre de noyaux par cellule.
 Cent cellules ont été notées par boîte
 Pour déterminer le nombre de chromosomes des hybrides
somatiques, les extrémités des racines ont été collectées,
prétraitées avec 0,03% d'hydroxyquinoléine pendant 2h 45min,
fixées dans de l'éthanol-acide acétique (3/1) pendant 24 h et
conservées dans 70% d'éthanol.
 Les extrémités des racines ont été colorées en utilisant la
méthodologie Feulgen et écrasées dans une goutte de 2% de
carmin acétique.
 Les lames ont été montrées dans canada balsam, au moins de
30 métaphases ont été analysées par plante.