Le marquage par photoaffinité couplé à la

spectrométrie de masse dans

l’identification de protéines.
Publication: Développement d'une sonde de photoaffinité à base de Raltégravir pour la capture de l'intégrase du VIH.
ACS Med. Chem. Letters 2020, 11,
1986-1992

Année Universitaire 2020-2021

P. Lucas, S. Meryem, Y. Binnur 1

 SOMMA
I. INTRODUCTION
IRE
II. PRINCIPE

III. LES PHOTOPHORES

IV. DIGESTION TRYPSIQUE

V. IDENTIFICATION PAR
SPECTROMÉTRIE DE MASSE

VI. EXEMPLE ( ANALYSE DE LA

PUBLICATION )
2
 INTRODUC
TION
LE MARQUAGE PAR PHOTOAFFINITÉ, UNE TECHNIQUE PUISSANTE EN
CHIMIE MÉDICINALE
➢ Utilisation d’une sonde chimique qui peut se lier de manière covalente à sa cible en retour d’une
activation par la lumière.
➢ Permet l’identification de nouvelles cibles médicamenteuses et les interactions moléculaires
➢ Permet l’analyse de l’emplacement et de la structure des sites de liaisons de la protéine

Curr. Top. Med. Chem. 2002, 2, 3

271-288.
 INTRODUC
TION
LA SONDE DE PHOTOAFFINITÉ IDÉAL

➢ Stable dans l’obscurité à une gamme de pH

➢ Activation à des longueurs d’onde qui endommage un minimum les molécules biologiques mais
qui génèrent des intermédiaires hautement réactifs.

➢ Degré de similitude élevée avec le composé parent avec des niveaux d'activité et d'affinité
comparables et une faible interférence stérique avec la liaison.

4
 PRINC
IPE
CONCEPTION DE LA SONDE DE PHOTOAFFINITÉ

Trois fonctionnalités importantes doivent être intégrés :

➢ Incorporation d’une unité d’affinité (=

pharmacophore)
⇒ responsable de la liaisons réversibles pour
cibler les protéines.

➢ Incorporation d’un groupement photoréactif

(= photophore)
⇒ permet la fixation permanente aux
pharmacophore.

➢ Incorporation d’une balise

Future Med. Chem.
⇒ vital pour la détection des adduits sonde- 2015, 72, 5
159-183.
PRINC
IPE

6
NNT :
 LES
PHOTOPHORES
➢ Définition : Entité chimique qui sous irradiation est capable de générer des
liaisons chimiques.
➢ Formation d’espèce réactive et création de liaisons covalentes irréversibles avec des résidus
d’acides aminés lors d’une photoactivation.

Le photophore doit respecter différents critères :

➢ Affinité suffisante pour la cible.

➢ Dimensions réduites.

➢ Stabilité chimique.

➢ Longueur d’ondes approprié.

➢ Capacité à former facilement liaison covalente. 7

 LES
PHOTOPHORES
LES PRINCIPAUX GROUPES PHOTORÉACTIFS UTILISÉS POUR LE MARQUAGE
PAR PHOTOAFFINITÉ

NNT :
8
 LES
PHOTOPHORES
LES
BENZOPHÉNO
A l’état excité ⇒ Fort caractère électrophile, donc capable de réagir
avec des liaisons inertes! NES
➢ Possède une grande stabilité chimique et possibilité d’être manipulé dans des conditions douce
sans risque de dégradation de protéines pendant le processus

Figure : Mécanisme de photoactivation de la

benzophénone

Biochem. 1994, 33, 5661-

9
 LES
PHOTOPHORES
LES
➢ Facilement synthétisés. PHENYLAZI
DE

Figure : Mécanisme de photoactivation des Haut. Curr. Chem. 2012, 324, 85-114.
phenyl azide

10
 LES
PHOTOPHORES
LES PHENYL
DIAZIRINE
➢ Possède une grande stabilité chimique et très résistant à la température, les nucléophiles, les conditions
acides et basiques

Figure : Mécanisme de la réactivité du carbène singulet

après irradiation.
Biochem. 1992, 31, 3738-
11
 LES
PHOTOPHORES
LES PHENYL
DIAZIRINE
➢ Possède une grande stabilité chimique et très résistant à la température, les nucléophiles, les conditions
acides et basiques

Figure : Mécanisme de la réactivité du carbène triplet

après irradiation.

NNT :
12
 DIGESTION
TRYPSIQUE
Site catalytique de la
trypsine

13
IDENTIFICATION
PAR MS

Mass. Spectrom. Rev. 2009, 28, 14

 EXEM
PLE

➢ Conception et synthèse d'une sonde de photo-affinité basée sur Raltegravir pour

la capture complète du VIH-1 integrase à utiliser dans une analyse de marquage
par photoaffinité approfondie.
➢ (VIH-1 IN) = enzyme virale responsable de la duplication du VIH qui
catalyse l’étape d’intégration de l’ADN complémentaire viral vers le génome
de l’hôte afin de former un provirus stable.

ACS Med. Chem. Letters 2020, 11, 15

1986-1992
 EXEM
PLE
Des inhibiteurs de l’intégrase sont des antirétroviraux. Ils agissent en empêchant le VIH d’intégrer son
message génétique (son ADN) dans celui de la cellule cible.

Ces inhibiteurs, inhibent l’étape de transfert de brin en agissant comme un groupe fonctionnel chélatant
des ions métalliques magnésium présent sur le site actif du domaine du noyau catalytique :

- l’Elvitégravir
- Le Dolutégravir
- Le Cabotégravir
- Le Raltégravir

ACS Med. Chem. Letters 2020, 11, 16

1986-1992
 EXEM
PLE

➢ Benzophénone utilisé en tant que photophore dans la chaîne latérale carboxamide du composé
pyrimidine dans le Raltégravir à la place du fragment para-fluoro benzyle.

ACS Med. Chem. Letters 2020, 11, 17

1986-1992
 EXEM
PLE
Comparaison de l’activité de la sonde avec comme référence
l’enzyme purifié

Inhibition de la sonde 16 fois moins puissant que HL et 40 fois

moins efficace par rapport au Raltégravir.

=> La nature des substituants dans la chaîne latérale

carboxamide du cycle pyrimidine influent la puissance du
composé pharmacophorique.

ACS Med. Chem. Letters 2020, 11, 18

1986-1992
 EXEM
PLE
Site de clivage et peptides générés après digestion tryptique et
identification du site catalytique de la protéine

ACS Med. Chem. Letters 2020, 11, 19

1986-1992
 CONCLUSI
ON
➢ Le marquage par photoaffinité (PAL) = marquage covalent d'une protéine par une
petite molécule

➢ Avantages dans variété d'applications en chimie médicinale, plus particulièrement

l'identification de cibles pour les hits des criblages phénotypiques.

➢ PAL peut marquer les protéines de faible abondance et de faible affinité.

➢ Appliquée à plusieurs étapes de la découverte de médicaments : cibles

moléculaires, l'identification des interactions hors cible ou indésirables et la
caractérisation des sites de liaison .

20
 OUVERTU
RE
➢ Utilisation de sonde à biotine en complément des PAL

Curr. Top. Med. Chem. 2002, 2, 21

271-288.
 MERCI
de votre
ATTENTION
des
QUESTIONS ?
22