biotechnologie végétale

La Culture in vitro

MOSTEPHA DELLA
NASSIMA
2010-2011
 Les biotechnologie: bases de la culture in vitro

La culture in vitro est une

biotechnologie qui existe
depuis le 19eme siècle
 Les biotechnologies végétales

Les Biotechnologies végétales ont pour but principal d’améliorer les espèces
végétales au niveau:
► de la production (rendement accrus, résistance aux maladies, adaptation
au sol et à l’environnement)
► de la conservation (conservation prolongée, maturation ralentie)
► des qualités gustatives et nutritives (teneur en sucres, en protéines)

Elles ont également pour but de:

► préserver sauvegarder les espèces rares
► multiplier en grand nombre
► caractériser et améliorer les connaissances fondamentales
► acquisition de nouvelles caractéristiques

Les biotechnologies concernent tout un ensemble de procédures. La

culture in vitro en fait partie, comme le génie génétique, la
transgenèse……..
 Les biotechnologies végétales

Les biotechnologies permettent de passer outre les problèmes inhérents à

la reproduction sexuée

Les limites inhérent à la

reproduction sexuée
Difficulté de réaliser des
croisements entre espèces
Les biotechnologies
Exploiter la diversité
Et faciliter les croisements
interspécifiques
Les techniques utilisées
•-Sauvetage d’embryons
interspécifiques
•Fusion de protoplastes
•Transgénèse

-Les cartes génétiques

Risque d’introduction dans la Connaitre le génome -Sélection assisté par marqueurs
nouvelle variété des Et maitriser l’apport de -Génomique
caractères indésirables nouvelles caractères -Transgénèse

Délais pour créer une
nouvelle variété et au nombre
de générations successives
-Haplo-diploïdisation
Diminuer la durée de -Culture d’embryons immatures
création -Sélection assisté par marqueurs
-Transgénèse
 La cellule végétale: Rappelle

L’organogenèse est assurée par les

méristèmes=amas de cellules
indifférenciées se divisant
activement.

L’organogenèse nécessite une

différenciation cellulaire

Les cellules végétales possèdent

l'aptitude à la dédifférenciation et à
la régénération d’un individu : c'est
la totipotence

La totipotence cellulaire
"toute cellule végétale est capable de régénérer un autre individu
identique à celui dont elle est issue".
 La cellule végétale: la totipotence

La totipotence implique des processus de dédifférenciation et différenciation

Une cellule différenciée:

► perte de la capacité mitotique
► maturation des organites
► augmentation de volume

Conditions de dédifférenciation:
► rompre les corrélations physiques et physiologiques avec les cellules
voisines
► culture en milieu artificiel
► addition d’activateurs de croissance
 La culture in vitro: définition et historique
Culture in vitro : plantes entières ou fragments de plantes (explants) placés hors de
leur environnement naturel en conditions stériles sur un milieu nutritif (matériel de
laboratoire originellement en verre).

1902, G.HABERLANDT un autrichien, énonce le concept de la totipotence cellulaire végétale.

Il réussit à faire survivre in vitro, quelques mois, mais sans multiplication, de petits amas
cellulaires.
1922 Aux Etats-Unis, W.J. ROBBINS et en Allemagne : W. KOTTE, obtiennent la croissance de
pointes de racines pendant quelques mois seulement.
1926 E. KUROSAWA découvre l'action de la gibbérelline sur la croissance, c'est la première
fois qu'une substance hormonale est extraite d'une plante.
1934 P.R. WHITE (U.S.A.) réussit une culture de racines de tomates.
1935 Le Professeur R.J. GAUTHERET, en France, cultive et multiplie des cellules cambiales de
saule en introduisant des auxines dans le milieu.
1939 R.J. GAUTHERET réussit des cultures indéfinies de tissus végétaux normaux de carotte.
Aujourd'hui la souche est toujours entretenue et les cellules continuent à proliférer.
1954 W.H. MUIR et col. obtiennent les premières cultures de cellules isolées à partir de cals
friables cultivés en milieu liquide agité.
1955 C.O. MILLER et col. découvrent que les cytokinines induisent des divisions cellulaires
dans des cultures de tissus de tabac.
1957 F. SKOOG et C. MILLER régénèrent des racines et des tiges à partir de cals sous
influence d'auxine et de cytokinine.
1962 T. MURASHIGE et F. SKOOG mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le
fameux milieu de culture M.S. utilisé largement en culture in vitro . Il s'agit d'un milieu contenant
des éléments minéraux, des vitamines du groupe B, du sucre, auxine et cytokinine.
 La culture in vitro : Méthodologie

Un explant + un milieu de culture stérile + un environnement donné

 Notion d’aseptie

L’asepsie est un principe de base de la culture in vitro

La stérilisation du matériel et des milieux :

 Produits chimiques (éthanol, eau de javel, …)
 Flamme
 Chaleur + pression autoclave
 Chaleur sèche fours ou étuves
 Rayons UV
 Filtration des solutions (filtre 0,22 CM)

Précautions car les milieux de culture sont favorables au développement des

microorganismes + microorganismes en suspension dans l’air + manipulateur
 La culture in vitro: appariellage

Une hotte à flux laminaire est une enceinte

dans laquelle de l'air stérilisé par filtration
est pulsé soit de haut en bas, soit d'arrière
en avant.

L'enceinte nettoyée et stérilisée

permet de réaliser des opérations
stériles, moyennant certaines
précautions
 La culture in vitro: appareillage

La chambre de culture : 3 paramètres

l’hygrométrie : l’humidité régnant dans les
récipients de culture est suffisante. Il n’est alors
pas nécessaire de prévoir de dispositifs
permettant le contrôle de l’hygrométrie de la
chambre de culture.

la température : de l’ordre de 22 à 25°C. Dans

certains cas, une alternance jour/nuit peut être
favorable (ex : 23°C le jour, 18°C la nuit). Des
levées de dormance ou des inductions florales
peuvent également avoir lieu par séjour à basse
température (5 à 10 °C).

la lumière : 2 facteurs interviennent, l’intensité de

l’éclairement et la
Photopériode. L’intensité lumineuse s’exprime en
LUX est peut varier de 2000 (déclenchement
d’organogenèse, entretien de certains tissus) à 10
000 Lux (nouvelle unité : CE/m2/s) (néoformation
de bourgeons, plantules) selon la culture. La
photopériode est souvent de 16 h de jour/8 h de
nuit.
 Milieu de culture

L’explant étant isolé de la plante-mère, ses besoins nutritifs sont alors

assurés par un milieu de culture.

Un milieu de culture comprend:

► un solvant (eau distillée)
► des éléments minéraux
► des substances organiques
► des vitamines
► éventuellement des régulateurs de croissance ou antibiotiques

Préparation de solutions mères concentrées puis diluées avant autoclavage

Le milieu de culture peut être:

► liquide (sous agitation)
► solide (solidifié par de la gélose ou de l’agar=extrait d’algues)
 Milieu de culture
Les constituants du milieu peuvent être classés en 4 catégories : les sels minéraux, les
éléments organiques, les régulateurs de croissance (hormones) et les produits
naturels complexes. Dépend du végétal ou du tissu.

Sels minéraux Substances Régulateurs de Produits naturels

organiques croissance complexes
Macro-elements Glucides Auxine Hydrolysat de
NH4NO3
KNO3 Vitamines Cytokinine caséine
CaCl2 Thiamines HCL Gibbérelline Peptone
MgSO4 - Pyridoxine Extrait de levure
KH2PO4
Micro-éléments Acide nicotinique Extrait de malt
MnSO4 - Myo-inositol Lait de coco
ZnSO4 -
H3BO3
KI
Na2MoO4 -
CuSO4 - 5 H2O
CoCl2 - 6 H2O
Fer EDTA
La composition des milieux varie en fonction du temps
(appauvrissement+ rejet) donc nécessité de repiquages.
 Rappels les régulateurs de croissance

Mérèse : multiplication cellulaire= méristèmes

Auxèse : augmentation de la taille des cellules = grandissement cellulaire

Meristéme apicale
caulinaire

Zone subapicale

Meristéme apicale
raccinaire
 Rappels les régulateurs de croissance: les cytokinines
Toutes les cytokinines sont des
analogues substitués de l’adénine
Quasiment tous les tissus peuvent
synthétiser des cytokinines
Certains tissus sont plus productifs :
tissus en croissance active
Racines, embryons, fruits…
Mais la synthèse principale se fait dans
la zone subapicale du bourgeon
racinaire
Les cytokinines migrent alors vers le
haut de la plante en suivant la sève
brute : par le xylème
Rôles in vitro :
· Stimule les divisions cellulaires;
· Régularise la morphogénèse (acquisition
de la forme);
· Stimule la croissance des bourgeons
axillaires;
· Contribue au renouvellement de la
chlorophylle.
 Rappels les régulateurs de croissance: les auxines

L'auxine se déplace préférentiellement

dans le phloème.

. Sa conduction est polarisée : elle

s'effectue plus facilement de l'apex vers
la base de l'organe.
Synthétisée dans méristèmes des
bourgeons apicaux caulinaires,
jeunes feuilles et embryons (un
peu) Rôles in vitro :
· Favorise la croissance de cals, les divisions
cellulaires, l’allongement cellulaire
Cette hormone doit être distribuée
· Favorise le développement de bourgeons
dans tous les tissus, y compris les
adventifs
racines, où elle s'accumule.
· Favorise l’enracinement.
(AIA/CYT)=1 : Multiplication
cellulaire mais pas de différenciation
= calogénèse

(AIA/CYT)<1 : Formation de
pousses à partir d’une masse de
cellules indifférenciées
= caulogénèse

(AIA/CYT)>1: Formation de racines

= rhizogénèse
 La culture in vitro: l’explant

L’explant = fragment de plante excisé et mis en culture

Il faut distinguer deux types de cultures :
► l’entretien d’une culture aseptique déjà établie et que l’on maintient par repiquage
► l’établissement d’une culture aseptique à partir de tissus prélevés sur une plante entière
cultivée en conditions non stériles.

Il faut alors stériliser correctement l’explant avant de les mettre en culture. les tissus
végétaux peuvent être contaminés par des virus, bactéries, champignons, levures,
acariens, …

Pour le choix de l’explant toutes les cellules sont aptes à entrer en division et à redonner un
individu complet semblable à celui dont elles sont issues.

Cependant, certaines réagissent mieux que d’autres, en fonction de :

► l’espèce végétale,
► du stade et de l’âge du pied mère
► de l’époque de prélèvement du type d’organe
 Culture stérile des explants: exemple de graines

Les graines sont stérilisées par une solution d’hypochlorite de sodium 5%.

► Les graines sont rincées 4 fois dans de l’eau distillée autoclavée.

► Les graines sont semées sur milieu de culture avec agar en boites stériles.

► Les boites sont fermées avec un ruban poreux et placées à 4°C.

Graines germées dans une boite de petri Graines germées dans un tube
 Problèmes rencontrés

Les infections
Champignons Contamination peut venir d’une
Bactéries
mauvaise stérilisation des milieux

Les problèmes de croissance de l’explant de culture, d’une mauvaise

Présence de substance toxique stérilisation des explants, ou
Milieu de culture non adapté
Explant trop âgé….. d’erreurs du manipulateur.
 Acclimatation
Acclimatation après la phase de culture in vitro (transfert sur sol):
Maintenir une humidité élevée
Bonne aération du substrat, bon pH
Contrôler la température
 Culture in vitro : technique et application
 La multiplication conforme: on peut reproduire à l'identique un individu et le
multiplier à partir de cellules ou d'un fragment d'organe.
 La culture de méristèmes: l'intérêt des méristèmes est qu’ils sont indemnes de virus,
leur culture donne des plantes saines.
 Le sauvetage d'embryons: embryons obtenus après la fécondation prélevés et mis en
culture in vitro (croisement interspécifique).
 L'haplodiploïdisation développement des individus à partir des gamètes (lignées
pures, haploïdes).
 Multiplication conforme ou micropropagation
La multiplication végétative (multiplication conforme) est un mode de reproduction
asexuée qui permet la propagation d’individus génétiquement identiques (individus
conformes à la plante mère), contrairement à la multiplication par voie sexuée qui
donne naissance à de nouveaux types génétiques.
Multiplication à partir de bourgeons préformés
Multiplication par néoformation de bourgeons adventifs sur l’explant adventif
Multiplication par embryogenèse somatique

Applications multiples :

► production de très grandes quantités de plants identiques au plant de départ

► constitution d’une collection de plantes à intérêt agronomique ou industriel

► sauvetage d’espèces en voie de disparition.

► Couramment utilisé pour la multiplication d’espèces fruitières (pommier, poirier,
framboisier, …), horticoles (rosier, dahlia, bégonia, …), et maraîchères (pomme de
terre, asperge, artichaut, ..).
 La multiplication à partir de bourgeon préformé

La multiplication à partir de bourgeons préformés consiste à provoquer ou

accélérer le débourrement d’un bourgeon normal de l’explant
La multiplication par néoformation de bourgeons adventifs

La multiplication par néoformation de bourgeons adventifs sur l’explant

adventif= en des endroits inhabituels

B C

D E

A: explant constitué d’un fragment d’organe ou de cellules isolées.

B: développement de bourgeons néoformés directement à partir du fragment initial sur
milieu riche en cytokinines.
C: développement de tiges
D: développement de cals
E-F : culture du cal primaire et développement de bourgeons
G: transfert des tiges sur milieu riche en auxine
Multiplication par embryogénèse somatique

Principe : provoquer la formation d’embryons somatiques (2n) à partir de fragments de

tissus ou de cellules isolées, les embryons formés étant capables de se développer en
plantule enracinée identique à la plante de départ.

Le choix de l’explant est primordial

Caractéristiques de
l’embryon somatique:

Structure bipolaire

Aucune connexion
vasculaire avec le
tissu sous-jacent

Pas de dormance
Multiplication par embryogénèse somatique

Les avantages de l’embryogénèse somatique:

Accélération de la micropropagation.
Tissu embryogéne
Utilisation de bioréacteur.

Les inconvénients de l’embryogénèse somatique:

L’aptitude à l’embryogénèse somatique peut
varier en fonction de l’espèce végétale et de la
partie de la plante utilisée.
Le passage par cal peut amener des risques de
dérives génétiques.
Embryons somatiques
Les applications:
Semences artificielles: création d’embryon
enrobés.
Synthèse de métabolites secondaires.
Clonage de ligneux
Plantes adaptées à l’embryogénèse

Germination des
embryons
 Culture de Méristème

Cas particulier de la multiplication végétative: utilisé dans l’éradication de nombreuses

maladies
Les méristèmes sont indemnes de tout microorganismes, même de virus.
Permet l’assainissement variétal d’éviter de nouvelles contaminations

Prélèvement de
bourgeon de la
plante à assainir.
Régénération
d’une plante
saine

Stérilisation, dissection et Repiquage

extraction du méristème

Mise en culture Division,

sur un milieu développement
nutritif de feuilles
 Culture de Méristème

Avantages:
multiplier des espèces chez lesquelles les semences sont rares
► Cas des haploïdes, des triploïdes, et plus généralement des polyploïdes au nombre
impair de chromosomes, d’aneuploïdes, de mutants particuliers, de beaucoup d’hybrides.
► Cas des variétés parthénocarpiques produisant des fruits sans fécondation
► Cas d’espèce à sexes séparés
► Cas d’espèce à floraison aléatoires

et où les techniques de bouturage sont difficilement applicables.

multiplication à l’infini du nombre de plantes à partir d’une seule plante mère avec gain de
temps.

nécessite peu d’espace et est indépendante des saisons.

les clones sont de plus assainis (débarrassés des microorganismes) et leur coût de
production est souvent plus faible (grand nombre de plantes produites par rapport à
l’unité de surface) car gain de temps et d’espace.
 Avantages et inconvénients de la multiplication in vitro

Inconvénients:

Population homogène donc toutes modifications du milieu à un impact sur la

totalité de la population.

modifications plus ou moins importantes du génotype des plantes obtenues

qui se traduisent par des modifications phénotypiques (physiologiques,
morphologiques, …)= variations somaclonales.

l’obtention de clones peut aussi nuire à la diversité génétique naturelle