BIOTECNOLOGIA E GENÉTICA

1. Introdução

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 GENÉTICA
UM POUCO DE HISTÓRIA

. 8 de Fevereiro de 1865  nascimento (Gegor Johann Mendel)

. Leis de Mendel:
1. os caracteres herdados são produzidos
por “fatores” independentes;
2. esses fatores (genes) se apresentão aos
pares no indivíduo, cada um originários de ca um
dos pais;
3. na formação dos gametas os dois genes
se separam ou segregam e apenas um de cada par
vai para o descendente.
ESTRUTURA DO DNA

. Início 1869 com Friedrich Mischer 

nucleína (glóbulos brancos, composto
fosfatado de natureza ácida).
A Natureza Química do Material Genético
. Metade do século XX  localização do material genético;
. 1914  F. Sanfelice, papel infectivo de uma
nucleoproteína encontrada em virose (“fowl pox”);
. 1928  Frederick Griffith, descreveu o "Princípio
Transformante";
. 1944  Avery, MacLeod e McCarty, definição da natureza
química do "Princípio Transformante";
. Alfred Hershey e Martha Chase  confirmação do DNA
como material da informação genética (utilização de isótopos
radioativos).
. 1953  James Watson e Francis Crick + Wilkins, definiram o modelo
tridimensional;
DNA uma Molécula de Estrutura Dinâmica
Não possui natureza estática;
Possuí as formas A, B, C, D e Z;
Pode ser facilmente destruído e remontado
(desnaturação):
. "Temperatura de Desnaturação Média" (TM  quanto  CG);

. Renaturação  quanto  o comprimento das seqüências maior o

tempo de renaturação ("Southern blot").
ESTRUTURA DO RNA
. O processo biológico é caracterizado essencialmente
pela capacidade de reprodução. Estes podem ser divididos
em duplicativo e transcritivo e processo tradutivo;

. O RNA possui papel central neste processos pois tem

funções múltiplas.
Constituição
. São fitas simples, transcrito a partir de uma das
fitas do DNA;
. Possuí três tipos funcionais diferentes
(ribossômico, transportador e mensageiro).
rRNA
. Corresponde a 80% do RNA total em bactérias e 95% em
eucariontes;
. Constituído de subunidades 16S (procariontes e
cloroplastos), 17S (protistas e leveduras) e 18S
(eucariontes mais complexos);
. Pouco conhecimento sobre a função de 16S, exceto
aquelas relacionadas aos sítios de acoplamento das
proteínas ribossômicas;
. Possuem seqüências conservadas, sendo utilizados nos
estudos de evolução e taxonomia;
. Existem outras subunidades como 5S, 23S.
RNA Transportador
. Corresponde a 15% do RNA total;
. São moléculas centrais no fluxo da informação
genética (possuem um códon e um aminoácido).
RNA Mensageiro:
. Corresponde a 2% do RNA total;
. Produtos finais da atividade auto-sintética dirigida a
síntese de proteínas específicas e selecionadas;
.cDNA.
 DUPLICAÇÃO DO DNA

Modelo semiconservativo

. Proposto inicialmente por Watson e Crick

(1953);

. Confirmado por Meselson e Stahl (1958).

 CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA

A expressão gênica é controlada

principalmente para que a célula possa obter o
melhor rendimento e custo energético.

Indução e Repressão Enzimática

. O lac Operon,
. O Operon de proteínas.
 MUTAÇÃO E REPARO

. Mutação e Recombinação  molas mestras

da variabilidade existentes entre os seres vivos;

. Mutação é qualquer modificação súbita e

hereditária no conjunto gênico de um organismo
que não é explicável pela recombinação da
variabilidade genética pré-existente;
 . As mutações podem ser basicamente divididas

em: Mutações espontâneas e Mutações

induzidas.
Transposons

Ocorre a adição ou a elisão de material genético.

Tipos de Mutantes
1 Mutantes auxotróficos
São mutantes que perderam a capacidade de se multiplicarem
em meio mínimo, letais no meio mínimo, eles podem ser
deficinetes nutricionais ou auxotróficos parciais;

2 Mutantes Incapazes de Utilização de Determinadas

Fontes de Carbono ou Nitrogênio
lac-, gal-, etc;
3 Mutantes Resistentes a Agentes Inibidores

Antibióticos (strR, tetR, etc), fagos, agentes

químicos (benR, chlR, etc);

4 Mutantes Morfológicos

Modificações na coloração, tamanho e formato da

colônia;
5 Mutantes para Produção de Substâncias
Liberadas pela Célula

Antibióticos, enzimas, ácidos orgânicos, etc;

6 Mutantes para a Locomoção e Comportamento

Inibição da síntese de flagelos (mot-) ou mutados

quanto à quimitaxia;
 Processos de Recombinação em Micro-
organismos

. Conjugação
. Transformação
. Transdução
 ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVEIS

. Em geral o genoma dos procariotos estão contidos em um único cromossomo

porém, estes organismos são portadores de uma quantidade de unidades
genéticas acessórias;

. Estas unidades são genericamente tratadas por elementos genéticos

móveis;

. Os elementos genéticos móveis são classificados em plasmídeos, elementos

genéticos transponíveis (transpons e IS) e os bacteriófagos.
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
. A Biologia Molecular sempre produziu nos cientistas da área
biológica especial fascínio, pois trata dos mecanismos de
armazenamento e decodificação da memória celular;
. Com a evolução da biologia molecular (genética bioquímica) nas
décadas de 50 e 60 do século passado, podemos dizer que a
Tecnologia do DNA Recombinante (TDR) na década de 70 foi
uma decorrência natural;
. Permite a recombinação gênica entre espécies distintas ("Poder
Criador").
 Ferramentas da TDR

1. Enzimas de Restrição

. Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição;

. Descobertas a partir de estudos a respeito do sistema de restrição-modificação de

células bacterianas infectadas por bacteriófagos;

. São classificadas em 3 tipos (I, II e III) de acordo com a especificidade de ação e

substratos requeridos;

. As enzimas tipo II são as mais importantes para a engenharia genética, pois

reconhecem seqüências palindrômicas específicas (sítios de clivagem ou sítios de

restrição) e cortam a fita dupla em fragmentos com extremidades colantes ou não ;

 PRINCIPAIS MÉTODOS DE CLONAGEM
MOLECULAR

1. Métodos de produção de DNA quimérico

. São dois os principais métodos de produção de DNAs quiméricos:

1. 1. Via Adição de Extremidades Homopoliméricas complementares:

. Dois grupos independentes da Universidade de Stanford (David Jackson,

Robert Symons & Paul Berg e Peter Lobban & A. Dale, 1972) construíram

“DNA quiméricos” utilizando a enzima terminal transferase.

TÉCNICAS DE HIBRIDAÇÃO
. A identificação dos raros fragmentos de um banco que contêm o
fragmento de DNA de interesse é a parte mais difícil da
clonagem;
. Esse problema é resolvido devido à complementariedade das
seqüências de DNA ou RNA, utilizando-se de uma técnica
conhecida como Hibridização dos Ácidos Nucléicos;
. Na hibridização ocorre a formação de compostos fita dupla
estáveis através do pareamento de bases;
. A estabilidade do dúplex formado esta diretamente relacionada
ao grau de complementariedade existente entre as duas fitas;
. As condições físicas para que a hibridização ocorra, podem ser
manipuladas (estringência);
. Assim sob condições de estringência severas a seqüência
utilizada como sonda somente irá hibridizar com uma
seqüência perfeitamente complementar a ela.
 SEQUENCIAMENTO DE DNA

. Existem dois métodos para o seqüênciamento:

1) o Método enzimático de Sanger;

2) o Método de degradação química do DNA.

 REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM
CADEIA (PCR)
. Consiste na amplificação in vitro de segmentos de DNA,
usando-se de dois primers que hibridizam com as fitas opostas,
em regiões que flanqueiam o segmento a ser amplificado;

. Aplicações: 1) Amplificação de regiões específicas do genoma

ou do cDNA, 2) Análise de polimorfismos de DNA, 3)
Diagnóstico de doenças genéticas, 4) Estudos de evolução
molecular, 5) Medicina forense, 6) Diagnóstico de doenças
infecciosas.
 FUSÃO DE PROTOPLASTOS EM
FUNGOS
. Produção de protoplastos em levedura inicialmente 1914;
. Grande quantidade de protoplastos em 1957.

Fusão Propriamente Dita

. Utilização de PEG;
. Eletrofusão