Vous êtes sur la page 1sur 68

Techniques de diagnostic biologique

de la toxoplasmose

Dr KABAMBA KALONJI Fiston


D.E.S Biologie clinique

1
Objectifs

• Définir la toxoplasmose

• Rappeler l’épidémiologie de la toxoplasmose

• Décrire les différentes techniques de diagnostic indirect et direct de la


toxoplasmose

• Préciser les indications de ces différentes techniques

2
Plan

Introduction

1. Rappels

2. Diagnostic biologique

3. Indications

Conclusion

3
Introduction

• Toxoplasmose
 Anthropozoonose cosmopolite due a un protozoaire intracellulaire
obligatoire du système RED : Toxoplasma gondii.
 Habituellement bénigne mais potentiellement grave chez le fœtus
et l’immunodéprimé

• Rôle du biologiste est à la fois diagnostique et dans le suivi de la


femme enceinte
4
1. Rappels

1.1 Agent causal


• Parasite se présente sous 3 formes évolutives :
 Forme végétative ou trophozoïte ou tachyzoïte
 Kyste contenant les bradyzoïtes
 Oocyste : Forme de dissémination du parasite retrouvée dans le
milieu extérieur (issue de la reproduction sexuée chez l’HI)

5
1. Rappels

1.2 Mode de contamination


• Ingestion d’oocystes
 Par consommation de fruits et légumes crus mal lavés ou d’eau
de boisson souillée
 Par l’intermédiaire de mains souillées après contact avec le sol
ou les animaux

6
1. Rappels

1.2 Mode de contamination


• Ingestion de kystes
• Transmission par les tachyzoïtes
 Par voie transplacentaire
 Par transfusion
 Par manipulation de souches dans les laboratoires spécialisés

7
1. Rappels

1.3 Cycle évolutif


• Cycle hétéroxène :
 Le parasite doit subir des transformations chez plusieurs hôtes
successifs et parfois dans le milieu extérieur
 Un ou plusieurs hôtes intermédiaires (Mammifères, oiseaux);
 Un hôte définitif (félidés);

8
1. Rappels

1.3 Cycle évolutif

Figure n°1: Cycle évolutif de T. gondii


9
1. Rappels

1.4 Physiopathologie
• Toxoplasmose acquise : Déroulement en 3 phases :
 Parasitémique
 Immunitaire et
 Chronique.

10
1. Rappels
1.4 Physiopathologie
• Toxoplasmose acquise : Déroulement en 3 phases :
 Parasitémique
 Durée 1 à 2 semaines.
 Caractérisée par la prolifération rapide des tachyzoïtes :
éclatement des cellules parasitées et infestation rapide de
nouvelles cellules (passage transitoire dans le sang qui rend
difficile le diagnostic direct)
11
1. Rappels

1.4 Physiopathologie
• Toxoplasmose acquise : Déroulement en 3 phases :
 Parasitémique
 Dissémination dans l’organisme par voie hématogène et
lymphatique.

12
1. Rappels

1.4 Physiopathologie
• Toxoplasmose acquise : Déroulement en 3 phases :
 Phase secondaire ou immunitaire
 Durée plus longue : 2 à 3 mois.
 S’installe progressivement, contrôle la multiplication du
parasite.

13
1. Rappels

1.4 Physiopathologie
• Toxoplasmose acquise : Déroulement en 3 phases :
 Phase secondaire ou immunitaire
 Sur le plan humoral, différents isotypes spécifiques (IgM,
IgA, IgG) apparaissent successivement et entraînent la lyse
des formes extra-cellulaires.

14
1. Rappels

1.4 Physiopathologie
• Toxoplasmose acquise : Déroulement en 3 phases :
 Phase secondaire ou immunitaire
 Apparition de l’immunité à médiation cellulaire
 Echappement du parasite (kystes).
 RI est définitive, protectrice mais non stérilisante.

15
1. Rappels
1.4 Physiopathologie
• Toxoplasmose acquise : Déroulement en 3 phases :

16
1. Rappels

1.4 Physiopathologie
• Toxoplasmose acquise : Déroulement en 3 phases :
 Phase tertiaire ou chronique
 Durée variable pouvant aller à de nombreuses années
 À la moindre défaillance du SI; la rupture des kystes
entraîne une reprise évolutive de la maladie.

17
1. Rappels
1.4 Physiopathologie
• Toxoplasmose congénitale
 Contamination se fait essentiellement pendant la phase
parasitaire maternelle par le passage transplacentaire du
parasite.
 Risque de contamination va augmenter avec l’âge de la
grossesse (fragilité du placenta)
 Gravité des lésions chez le fœtus diminue avec l’âge de la
grossesse.
18
2. Diagnostic biologique

• Diagnostic indirect : Sérologique


 Mise en évidence directe du parasite étant souvent difficile, le
diagnostic est presque toujours indirect reposant sur des
examens sérologiques.
 Diagnostic repose sur détection de 2 isotypes d’Ig dont les IgG et
les IgM ou les isotypes IgA

19
2. Diagnostic biologique

20
2. Diagnostic biologique

•Diagnostic direct : Recherche des tachyzoïtes dans le sang total, la MO, le

liquide amniotique, le placenta, le sang du cordon par:


Microscopie : frottis coloré au MGG
Culture
Inoculation à l’animal
Biologie moléculaire
Techniques soit non utilisées en routine, soit peu sensibles, soit onéreuses,
méthodes indirectes+++

21
Diagnostic indirect

22
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

1. Phase pré-analytique

• Conditions : patient idéalement à jeun depuis 12H, ayant consommé


un repas léger la veille

• Prélèvement : sang veineux prélevé dans un tube sec

• Transport : acheminer rapidement au laboratoire


• Pré-traitement : centrifuger et séparer le sérum (conservé à -20°C si
analyse différée) 
23
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 

Techniques de recherche et de titration des IgG


• Dye test : utilise les Ag figurés
• Techniques Elisa et CLIA
• Mesures de l’avidité des IgG 

24
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
 Test de lyse (Dye-test) : technique de référence

• Principe : c'est un test de lyse des parasites reposant sur la


cytotoxicité médiée par des anticorps et le complément. Il permet la
recherche et le titrage des Ac spécifiques de type IgG anti T. gondii.

25
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
 Test de lyse (Dye-test) : technique de référence

• Technique :

- Mettre en présence une suspension de toxoplasmes vivants avec des


dilutions du sérum décomplémenté et une source de complément

- Incuber

- Lire après incubation au microscope à contraste de phase


26
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 

Figure n°2 : Technique du test de lyse (Dye-test)


27
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
•Résultats
- Au microscope à contraste de phase, les toxoplasmes lysés apparaissent
grisâtres alors que les toxoplasmes vivants sont réfringents.
-R°(+) si 50%des parasites sont lysés par les Ac
-Titre réaction positive (exprimé en UI/ml) est donnée par inverse dernière
dilution entraînant la mort de 50% des toxoplasmes

28
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect
2. Phase analytique 
• Avantages

- Méthode de lecture simple, reproductible et quantitative


- Technique sensible et spécifique

• Inconvénients

- Elle nécessite l’entretien d’une souche de toxoplasme avec un risque de


contamination au laboratoire

- Onéreuse, elle est réservée à quelques laboratoires spécialisés.


29
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect
2. Phase analytique 

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)
•Principe : c’est une réaction Ag/Ac révélée par une enzyme conjuguée dont
l’activité est mise en évidence par un substrat chromogène
•Technique
- Incuber le sérum à dilution unique dans un des puits de la microplaque
renfermant l’Ag fixé sur sa paroi.
- Laver après incubation, ajouter le conjugué anti-Ig couplé à une enzyme et
incuber.
30
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect
2. Phase analytique 
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)

• Technique
- Mesurer la réaction colorimétrique par un spectrophotomètre.

31
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)
•Résultat
- résultat obtenu est une densité optique convertie en UI par
comparaison avec une courbe étalon établie avec une série de sérums.
•Avantages
- technique sensible et automatisable (automate) permettant de traiter
de grandes séries avec une lecture objective par un spectrophotomètre.
•Inconvénient : relativement onéreuse.
32
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect
2. Phase analytique 

 CLIA

• Même principe que ELISA mais marqueur = composé


chimiluminescent (Acridinium).

33
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect
2. Phase analytique 
 Mesure de l’avidité des IgG

• Elle correspond à l'affinité fonctionnelle moyenne d'un ensemble d'anticorps


dirigés vers un ensemble d'antigènes

• L’avidité des IgG augmente au cours de l'évolution de la réponse humorale et


permet de dater l’infection

• Les IgG sont de faible avidité au début de l'infection et de forte avidité en cas
d'infection ancienne.
34
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
Mesure de l’avidité des IgG
•Principe : Consiste à mesurer intensité liaison Ag/Ac en présence d’un agent
dissociant.
•Technique

- Se fait par des adaptations des techniques ELISA

- Introduction agent perturbant liaison Ag-Ac (agent dissociant=urée) au cours

test ELISA

- Rapport des titres obtenus avec ou sans agent dissociant


35
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect
2. Phase analytique 
 Mesure de l’avidité des IgG

• Résultat
o Valeur seuil du coefficient d’avidité est déterminée par chaque
laboratoire en fonction du dissociant et de la technique utilisée

• Avantage : technique simple, reproductible

• Inconvénient : technique onéreuse


36
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 

 Recherche et titrage des IgM

- ImmunoSorbent Agglutination Assay (ISAGA)

- Immunofluorescence indirect ou test de Remington :


Technique de référence

37
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
Immunofluorescence indirect ou test de Remington
•Principe: Réaction Ag/Ac révélée par la fluorescéine dont l’Ag est un
dépôt de toxoplasmes formolés sur une lame
•Technique:
- Incubation du sérum à différentes dilutions sur plaque avec
antigènes fixés
- Fixation des Ac spécifiques est révélée par un Ac (conjugué anti
IgM) marqué à la fluorescéine
- Lecture au microscope à fluorescence 38
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
 Immunofluorescence indirect ou test de Remington

39
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
Immunofluorescence indirect ou test de Remington
•Résultats:
- Titre exprimé en UI/ml correspond à l’inverse dernière dilution pour
laquelle l’intégralité membrane des parasites apparaît bien fluorescente
•Avantages : Technique sensible, Quantitative, Exécution facile

40
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
Immunofluorescence indirect ou test de Remington
•Inconvénients
- Nécessité microscope à fluorescence
- Problème de reproductibilité des examens car lecture opérateur
dépendant
- Faux positifs en IgM par réaction croisée avec le facteur rhumatoïde

41
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
 ImmunoSorbent Agglutination Assay (ISAGA)

• Principe : c’est un test qui consiste à mettre en évidence des Ac


spécifiques par immuno-capture suivie d’agglutination en utilisant
comme Ag des toxoplasmes formolés.

42
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 

ImmunoSorbent Agglutination Assay (ISAGA)


•Technique 
- Sensibilisation fond des puits de plaques de microtitration (fond en U)
par des Ac monoclonaux humain anti-IgM
- Incubation du sérum humain dans ces cupules permet une capture des
IgM, spécifiques ou non de Toxoplasma gondii
- Après lavage une suspension de toxoplasmes est ajoutée dans les cupules

43
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
 ImmunoSorbent Agglutination Assay (ISAGA)

• Résultats

- Agglutination dans cupules contenant des anticorps anti Ig M anti


toxoplasmiques se manifestant par un voile au fond de la cupule.

- Réaction négative se manifeste par un bouton de sédimentation

44
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

2. Phase analytique 
 Recherche des IgA

• En routine par ISAGA et ELISA.

45
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

3. Phase post-analytique

• Différentes techniques utilisées permettent de détecter les Ac


spécifiques anti-toxoplasmiques qui apparaissent selon une cinétique
bien précise

• Résultats doivent être confrontés au seuil de positivité du réactif


considéré.
 
46
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

Tests utilisés en Parasitologie

• Automate architect utilisant le principe de chimiluminescence (CLIA)

• VIDAS utilisant le principe ISAGA

47
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect
 Automate architect utilisant le principe de chimiluminescence (CLIA)

Figure n°3 : Automate architect


Source: LRPM
48
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

• Principe
-IgM et/ou IgG à doser contenus dans sérum, mis au contact de microparticules
paramagnétiques recouvertes d’Ag recombinés (P30 et p35) complexe Ag-Ac
qui se conjugue aux Ig murins (anti IgG ou IgM humains) sensibilisés à
l’acridinium se révèle en produisant une réaction chimiluminescente

-Réaction mesurée par le système optique de ARCHITECT en URL dont

l’intensité est proportionnelle à la quantité d’anticorps présents dans

l’échantillon.

49
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect


Automate architect utilisant le principe de chimiluminescence (CLIA)

•Technique:

Echantillon prédilué, le diluant de dosage et les microparticules

paramagnétiques recouvertes d’Ag reconbinants de Toxoplasma gondii (P30

et P35) sont mis en présence. Les anticorps spécifiques anti toxoplasma

gondii présents dans le sérum de l’achantillon se lient aux microparticules

recouvertes d’antigènes.

50
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

Automate architect utilisant le principe de chimiluminescence (CLIA)


•Technique:


Après un lavage, le conjugué d’anticorps (murins) anti-IgG humaines

marqué à l’acridinium est ajouté pour formé un mélange réactionnel


Après un autre cycle de lavage, les solutions de préactivation et

d’activation sont ajoutées au mélange réactionnel.

51
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

Automate architect utilisant le principe de chimiluminescence (CLIA)

• Technique:
La réaction chimiluminescente résultante est mésurée en unités rélatives
(URL).
Il existe une relation directe entre la quantité d’anticorps IgG anti-toxo
présentes dans l’échantillon et le nombre d’URL détectées par le système
optique ARCHITECT.

52
2. Diagnostic biologique
2.1 Diagnostic indirect

 Automate architect utilisant le principe de chimiluminescence


(CLIA)

• Rendu des résultats


 Seuil de positivité et technique utilisée doivent toujours figurer
sur le compte rendu.
 Pour l’étude cinétique des Ac, la même technique doit être réalisée
sur chaque prélèvement successif et dans le même laboratoire
53
Diagnostic direct

54
2. Diagnostic biologique
2.2 Diagnostic direct

• Prélèvement
Toxoplasmose congénitale

- Liquide amniotique (18ème semaine)


- Sang fœtal (20 à 24ème semaine)
- Sang du cordon
- Biopsie du placenta

55
2. Diagnostic biologique
2.2 Diagnostic direct

•Prélèvement


Toxoplasmose de l’ID
- Sang
- Moelle osseuse
- LCR
- Liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA)
- ganglions
- Biopsies d’organe (cerveau)
56
2. Diagnostic biologique
2.2 Diagnostic direct

• Examen direct

- Réalisation frottis ou apposition


- fixation et coloration au May Grünwald Giemsa
- Recherche de formes tachyzoïtes et bradyzoïtes

57
2. Diagnostic biologique
2.2 Diagnostic direct

• Examen direct

Résultats

- Forme d’arc avec un bord concave et un convexe

- Pôle antérieur effilé

- Pôle postérieur renflé: où se situe noyau

- Parfois bradyzoïtes regroupés en pseudo-kystes (biopsies cérébrales)


58
2. Diagnostic biologique
2.2 Diagnostic direct

• Examen direct

 Résultats

Figure n°4: Examen direct après coloration a MGG


59
2. Diagnostic biologique
2.2 Diagnostic direct

• Examen direct
Avantage: facile à mettre en œuvre
Inconvénients:

- Prélèvement délicat
- Faible sensibilité (faible abondance des parasites)

60
2. Diagnostic biologique
2.2 Diagnostic direct

• Culture cellulaire

- Culture sur des cellules spéciales: fibroblastes murine 


Isolement pour typage
- Réservée aux laboratoires spécialisées

61
2. Diagnostic biologique
2.2 Diagnostic direct

• Inoculation à l’animal = Technique de référence ++++


 Inoculation par voie intra-péritonéale à des souris toxo(-)
 Résultats ne peuvent être connus qu’au bout de 30 à 45 jrs

- examen du liquide de lavage péritonéal 4 à 6 semaines plus tard


pour sérologie
- Recherche de kystes dans le cerveau de l’animal sacrifié

62
2. Diagnostic biologique
2.2 Diagnostic direct

• Inoculation à l’animal = Technique de référence ++++

Figure n° 5 : Kyste cérébral de T. gondii chez une souris sacrifiée après inoculation
63
2. Diagnostic biologique
2.2 Diagnostic direct

• Inoculation à l’animal = Technique de référence ++++


Avantages : spécificité de 100%
 Inconvénients

- Faible sensibilité
- Long délai de réponse
- Nécessite une animalerie

64
2. Diagnostic biologique
2.2 Diagnostic direct

• PCR: technique d’amplification du génome parasitaire


Avantages

- Tout type de prélèvement


- Plus sensible que l’inoculation à l’animal et spécificité 100%
 Inconvénients: onéreux

65
3. Indications

•Toxoplasmose congénitale: en cas séroconversion en cours de grossesse


Diagnostic anténatal
-Aminocentèse  PCR et inoculation
Diagnostic néonatal:
- PCR et/ou inoculation sur sang du cordon, sang périphérique ou
placenta
- Sérologie puis comparaison au profil immunologique de la mère
(par immunoblot)

66
3. Indications

• Toxoplasmose sujet immunocompétent

- Diagnostic sérologique

• Toxoplasmose chez immunodéprimé

- Diagnostic sérologique
- Diagnostic de certitude mise en évidence parasite (culture cellulaire,
PCR, inoculation)
- Biopsie cérébrale en dernier recours
67
Conclusion

• Toxoplasmose: Anthropozoonose cosmopolite due à Toxoplasma


gondii

• Formes graves=forme congénitale et forme de l’ID

• Diagnostic biologique repose essentiellement examens


immunologiques, recherche directe du parasite et techniques
moléculaires.

68

Vous aimerez peut-être aussi