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TP1: IDENTIFICATION PHENOTYPIQUE DES

BACTERIES
BUT:

Identification phénotypique des bactéries et ce ci en


effectuant:

- Un examen microscopique : état frais et coloration de Gram

- Test de l’oxydase

- Identification biochimique sur différent milieux de culture


La famille des Entérobactériacae est définit par les caractères suivants :

- bacilles à Gram négatif (2 à 4 µm de long sur 0,4 à 0,6 µmde large),

- mobiles avec ciliature péritriche ou immobiles,

- poussant sur milieux de culture ordinaires,

- aérobies - anaérobies facultatifs ( AAF),

-fermentant le glucose avec ou sans production de gaz,

- réduisant les nitrates en nitrites,

- oxydase négatif.
La famille des Pseudomonaceae comprend une soixantaine d'espèces pouvant
répondre à la définition suivante :

- bacilles à Gram négatif

    - aérobies stricts (AS)

- capables de se multiplier sur milieux usuels


   
- mobiles par ciliature polaire (sauf Pseudomonas mallei)

    - possédant une oxydase

- incapables de fermenter le glucose


   
- pouvant produire des pigments

   

   
1/ Examen microsopique: Coloration de Gram
ETAPES RÔLES Gram + Gram -
Avant la
coloration
Le violet de gentiane traverse la
Etape 1 Coloration paroi et les membranes des
primaire bactéries
Violet de gentiane puis colore le cytoplasme
Le Lugol provoque une
combinaison chimique entre le
violet de gentiane et les
Fixation composants cytoplasmiques
Etape 2
par des bactéries et fixe ainsi la
le lugol coloration dans le cytoplasme.
Tous les éléments sont
colorés en violet / noir.
L’alcool traverse uniquement la
Décoloration paroi des bactéries Gram –
Etape 3
à l’alcool et décolore le cytoplasme

Coloration La fuschine traverse la paroi des


Etape 4 bactéries Gram – et Gram +
secondaire
et colore le cytoplasme
Fuschine
I- Etude du Métabolisme Energétique

1-Etude du type respiratoire

Incubation 24 h à 37°C

Milieu VF
Résultat
avant utilisation

A- Si elle pousse le long du tube => Bactérie aérobie anaérobie facultative


B- Si la bactérie pousse à la surface du tube => Bactérie aérobie stricte
C- Si la bactérie pousse dans une zone intermédiaire => Bactérie micro aérophile
D- Si la bactérie pousse au fond du tube => Bactérie anaérobie stricte
2- Etude des enzymes respiratoires : Catalase +Oxydase

- Recherche de la Catalase
2- Etude des enzymes respiratoires : catalase +oxydase

- Technique de la recherche du Catalase


Catalase

2 H2O2 O2 + 2 H2O

- S’il y a effervescence  Cat +


- S’il y a absence d’effervescence  Cat -
2- Etude des enzymes respiratoires : catalase +oxydase

- Recherche de l’Oxydase
- Technique de recherche de l’Oxydase

N-N dimethyl-
paraphénylène diamine

Pipette Pasteur

Aucune Tache  Oxydase - Tache violette  Oxydase +


II- Etude du métabolisme glucidique: Voies
d’attaques des Glucides

Etude effectué sur milieu Hugh et Leifson : milieu semi liquide contenant un
indicateur de PH : le Bleu de bromothymol ou le rouge de phénol.

-Les bactéries peuvent utilisées le Glucose selon 2 voies:

Voie Fermentative : la Réaction se déroulent en absence d’oxygène provoquant


une baisse de pH du milieu suite à la formation d’acide

 Voie Oxydative: l’oxygène de l’air est obligatoirement utilisé , donc il y a peu


d’acide formé et l’acidification aura lieu uniquement à la surface
Le milieu reste tel qu’il
Aucun virage dans les 2
- Technique était avant tubes
ensemencement.  Germe inactif vis à
Il n’y a pas de culture.
Les bactéries sont inertes vis du Glucose
vis-à-vis du glucose

Virage au jaune débutant


dans le tube ouvert

Virage de l’indicateur de pH au
jaune dans la partie supérieure
Incubation du tube. Le milieu est devenu
acide.
Ouvert Il y a utilisation du glucose par
48h à 37°C les bactéries en présence d’ O2.
Les bactéries sont oxydatives
vis-à-vis du glucose.

Milieu Hugh et
Virage de l’indicateur de pH
Leifson + Glucose au jaune dans tout le tube. Le Virage au jaune dans les 2
Ensemencement milieu est devenu acide. tubes
Il y a eu production d’acides
lors de l’utilisation du glucose
par les bactéries en présence
et en absence d’O2.
Fermé: Les bactéries sont
(+ Huile de paraffine) fermentatives vis-à-vis du
glucose.
III- Métabolisme du Lactose: Milieu Kligler–Hajna
Ensemencement
Milieu rouge qui permet de dégager 4
caractères:
 L’utilisation du Lactose 2) Stries serrées
L’utilisation du Glucose sur la pente
La production de H2S Öse ou pipette
1) Piqûre centrale boutonnée
La production de Gaz
dans le culot
Fil droit ou
pipette boutonnée

1- La lecture du lactose au niveau de la pente:


• Si virage vers le jaune => la bactérie possèdent la βgalactosidase Lac +
• Si pente rouge : Bactérie ne possède pas de β Galactosidase  Lact -

2- la lecture du Glucose au niveau du culot :


• Si culot rouge  Bactérie Glucose –
• Si culot Jaune  Bactérie Glucose + 1
3
3- Production de H2S à partir du thiosulfate du milieu 4
H2S + Fe III précipité noir ( Sulfure de Fer) => H2S + 2
4- Production de Gaz : Si il y a présence de bulles ou bien décollement du gélose  Gaz +
Sinon  Gaz -
- Lecture du milieu Kligler Hajna

Exemple

Lactose - - + -
Glucose - + + + ONPG ??
H2S - + - +
Gaz - - + -
- Test à l’ONPG (Ortho Nitro Phényl β Galactoside)
La dégradation du lactose par les micro-organismes passe par sa transformation en
glucose. Elle n’est possible que s’il y si ces micro-organismes posédent :
- La β Galactosidase perméase
- La β Galactosidase

β Galactosidase
Lactose + H2O Glucose + Galactose
Absence de β Galactosidase
Si la Bactérie  Bactérie Lac – (vrai)

Glu + , Lac - Présence de β Galactosidase + β Galactoside


perméase membranaire défectueuse

ONPG
(substrat artificielle)
Milieu d'ONPG :

Ce test permet de rechercher la présence d'une enzyme intracellulaire


ß-galactosidase (ONPG hydrolase) qui permet l'hydrolyse du lactose en
glucose et galactose.

Une bactérie lactose- peut l’être pour 2 raisons :


- Absence de ß-galactosidase.
-  Absence de ß-galactoside perméase
Le test ONPG permet de recherche directement la présence de ß-galactosidase en
fournissant à la bactérie un substrat de cette enzyme :
L'orthonitrophényl- â-D-galactopyranoside.
Recherche de la -galactosidase

1) Faire une suspension


épaisse à partir de
colonies prélevées sur la
pente

2) Ajouter stérilement un
disque ONPG
Elle s’effectue sur un
tube de Kligler LAC -
3) Incuber à 37°C
pendant 30 minutes

1) Le tube reste incolore. 2) La suspension est


 absence de la - colorée en jaune 
galactosidase : ONPG - présence de la -
galactosidase : ONPG +,
mais absence de la
perméase.
IV- Recherche de quelques enzymes
1- Recherche de la Nitrate réductase : Bouillon Nitrate (NO 3 - )
Nitrate Réductase
- + -
NO 3 + 2H + 2 e NO2-+ H2 0
Stade Nitrite
Nitrate Réductase
NO 3- + 6 H + + 5 e - ½ N2 + 3 H2 O
Stade Azote : Stade Gazeux
Technique
Virage au Rouge Stade Nitrite
=> Nitrate Réductase +

Ensemencement
Nit1 +Nit2 Virage au Rouge 
24h à 37°C Nitrate Réductase -

Bouillon Nitrate Ajout de Zinc Pas de virage : Stade


(NO 3 -) Azote  Nitrate
Réductase +
Ex: Pseudomonas
Le Zn a la propriété de réduire les nitrates en nitrite.
Cet ajout va répondre à deux interrogations :

-premier cas : la bactérie ne possède pas la nitrate


réductase. L'ajout de Zn va réduire les nitrates en
nitrites qui vont réagir avec les réactifs de Griess
(Nit1 et Nit2)

- deuxième cas : la bactérie possède une nitrate


réductase très active qui a réduit les nitrates
jusqu'au stade azote moléculaire N2(=diazote).
Dans ce cas l'ajout de Zn ne provoquera pas la
réduction des nitrates car il n'en reste plus dans le
milieu.
2- Recherche de l’Uréase, Tryptophanase et Tryptophane
désaminase (TDA):
Milieu Urée Indole
-Recherche de l’Uréase

Coloration orange jaune :


pas d’hydrolyse de l’Urée

 Uréase -
Ensemencement

Incubation
24h à 37°C

Coloration Rouge : hydrolyse


Milieu Urée Indole de l’Urée
 Uréase +
- Recherche de la Tryptophane Désaminase: TDA

TDA
Tryptophane + H2O Acide Indole pyruvique

Quelques gouttes de
chlorure de Fer III

Urée Indole

Si précipité marron: la bactérie a dégradé la tryptophane avec la tryptophane


désaminase  TDA +
 Absence de précipité : La bactérie n'a pas dégradé la tryptophane avec la TDA
 TDA-
- Recherche de la Tryptophanase

Tryptophanase

Tryptophane + H2O Indole + Acide 2 –céto-propanoique + Acide


Ammoniac pyruvique

Réactif de Kovacs
-Présence d’un
anneau Rouge :
Indole +

-Absence d’un
anneau Rouge :
Indole -
Milieu Citrate de Simmons
Ce milieu permet de mettre en évidence l'utilisation du citrate
comme seule source de carbone et d'énergie. Ce caractère
est intéressant pour discriminer les bactérie entre-elles et ainsi
de les identifier.
Milieu Mannitol - mobilité - nitrate

 Caractères lus sur MMN (Mannitol-Mobilité-Nitrate) :

- deux caractères sont lus directement : l'utilisation du


mannitol et la mobilité de la bactérie.
- un caractère est lu indirectement après ajout des
réactifs
LES MILIEUX D’IDENTIFICATION DES PSEUDOMONAS
1. Le Milieu King A et King b
Composition
King A King B
Source de C et N

Peptone de gélatine 20 g Peptone de gélatine 20 g


Glycérol 10 g Source de C Glycérol 10 g
Chlorure de magnésium 1,4 g Source minérale Phosphate dipotassique 1,5 g
Sulfate de potassium 10 g Source minérale
Sulfate de magnésium 1,5 g
Agar (gélose) 13,6 g Agar (gélose) 13,6 g
ED pH = 7,2 qsp 1 L ED qsp 1 L
pH = 7,2
Lecture
King A et King b

King A bleu et King B vert. King A incolore et King B vert.


Production des deux pigments: Production de pyoverdine
Le milieu reste inchangé. pyocyanine et pyoverdine uniquement
Pas de production de pigment.
2. Le Milieu cétrimide

Composition
Molécules organiques azotées
Peptone 20 g
Sulfate de potassium 10 g
Chlorure de magnésium 3 g Sels minéraux
Phosphate dipotassique 0,3 g
Cétrimide 0,3 g
Inhibiteur
Agar (gélose) 13,5 g
ED qsp 1 L
pH = 7,2
Lecture

Présence de colonies sur le


milieu.
Les bactéries poussent en
présence de cétrimide :
suspicion de Pseudomonas et
Colonies bleu-vert sur la gélose.
apparentés.
Les bactéries produisent un pigment : la
pyocyanine.
Suspicion de Pseudomonas aeruginosa.
VI- Identification Biochimique des Bactéries :Galerie API 20E

1- Présentation de la galerie

Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin


d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE.

cupule

microtube contenant le milieu déshydraté


La suspension bactérienne introduite dans le tube dissout les substrats déshydratés
2- Préparation de l’inoculum

1 seule colonie

Prélèvement
d’une souche
isolement pure

5 mL d’ED stérile

Suspension d’opacité 0,5 sur l’échelle de Mac


Farland
3- Ensemencement de la galerie API 20 E

Introduire la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une pipette Pasteur
stérile, pointe appuyée à l’intérieur et sur le côté pour éviter la formation de bulles

Pour certains caractères:

Remplir le tube de suspension et recouvrir


Remplir de suspension le tube et la d’huile de paraffine
cupule ADH, LDC, ODC, H2S, URE
CIT, VP, GEL
Les 10 premiers tests
Tests négatifs

Tests positifs
Les 10 derniers tests

Tests négatifs

Tests positifs
5- Identification de la souche
Résultats de la galerie:

- + + + +

5 2 1 5 7 7 3 5 5
Résultats reportés sur la fiche d’identification

Code n°: 5 215 773 (55)

Se référer au catalogue pour identifier la souche à l’aide du code


TRAVAIL DEMANDE

1- Etude du métabolisme énergétique


•Recherche de la catalase si la souche est un Cocci Gram +
•Recherche de l’oxydase si la souche est Bacille Gram –
•Type respiratoire: Milieu VF

2- Etude du métabolisme Glucidique: Milieu Hugh-Leifson

3-Recherche des Enzymes :


•Uréase, TDA et la Tryptophanase: Milieu Urée Indole

4- Etude du métabolisme du Lactose: Milieu Kligler- Hajna et test à l’ONPG

5- Recherche des pigments carctéristiques: Milieux King A et King B

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