Vous êtes sur la page 1sur 32

Partie II Méthodes de fractionnement

( Techniques de Purification )

Moyens de purification Il existe plusieurs moyens de


purification:
La sédimentation et la centrifugation.
La filtration.
La dialyse
 La chromatographie.
L’électrophorèse.
Sédimentation et la Centrifugation
1 sédimentation
Géneralité
Les techniques de sédimentation gravitaires ou centrifuges, séparent un
mélange en deux phases non miscibles grâce à la différence de masse volumique
entre ces phases.
Dans la décantation, seule intervient la gravité ou effet de la pesanteur. Dans la
centrifugation, la gravité est remplacée par la force centrifuge dont l’intensité
peut être beaucoup plus grande.

Dépôt d'une boue argileuse


Suivez la sédimentation photographies réalisées toutes
les dix minutes
Les techniques de sédimentation sont des procédés de séparation
de deux phases dont l’une ou l’autre ou les deux à la fois présentent
un intérêt :
- Si les deux phases obtenues sont récupérées, cette sédimentation
joue un rôle de séparation (écrémage du lait).
Les techniques de sédimentation

- Lorsque la phase mineure est


rejetée et la phase majeure (milieu de
dispersion) est récupérée, la
sédimentation joue un rôle de
clarification (jus de fruits).

- Si la phase majeure est rejetée et la phase mineure récupérée, la


sédimentation joue un rôle de concentration (levurerie).
•Sédimentation :
Principe de la sédimentation
Lors de la sédimentation de particules solides de masse m, de
diamètre d et de masse volumique S (Rhô) dans un milieu fluide de
masse volumique  L et de viscosité µ (mu), au repos, les particules
sont soumises à l’action de trois forces :

•le poids,
•la poussée d’Archimède,
•les forces de frottement exercées sur la
particule par le fluide, du fait de sa
viscosité.
La loi de Stokes permet de prédire la vitesse limite de chute d'une
sphère (particule) soumise à la pesanteur dans un fluide. Lorsque le
poids, la poussée d’Archimède et la force de frottement du fluide sur
la particule s'équilibrent, il vient :

2
2 𝑟 𝑔 ( ρ 𝑝 − ρ𝑙 )
 

𝑣=
avec :

ν : vitesse de sédimentation (en m/s) ;
r , rayon de la sphère (en m) ;
g , accélération de la pesanteur (en m/s2) ;
p - L, différence de masse volumique  entre la particule et
le liquide (fluide) (en kg/m3) ;
µ , viscosité de liquide (en Pa⋅s).
NB1 :En conséquence, la vitesse de sédimentation augmente avec la
différence de masse volumique particule-fluide p - L , l’accélération de la
pesanteur g, le diamètre de la particule.

NB2 : La vitesse de sédimentation diminue lorsque la viscosité du milieu


augmente, ou le diamètre des particules diminue. Les particules de plus gros
diamètre sédimentent plus rapidement que les particules de petit diamètre.

2
2 𝑟 𝑔 ( ρ 𝑝 − ρ𝑙 )
 

𝑣=

Partie II méthodes de fractionnement
( Techniques de Purification )
Centrifugation
1 Introduction
Dans certains cas (fluides biologiques, extraits cellulaires) et dans les
liquides particulièrement visqueux la sédimentation est relativement
lente pour les très fines particules qui sont sensibles à l'agitation
thermique.

La centrifugation est une sédimentation accélérée dans laquelle g


(=l’accélération de la pesanteur) est remplacée par l’accélération
centrifuge.
2 .Principe de la centrifugation :
lorsque les particules en suspension dans leur solvant sont ainsi placées dans le
rotor d’une centrifugeuse; la mise en oeuvre de la centrifugation génère une
accélération qui pousse les particules vers l’extérieur du rotor, donc vers le fond
du tube de centrifugation.
3. Vitesse de centrifugation
vitesse de sédimentation dans le champ centrifuge (centrifugation) :
 
Rω2

µ : viscosité dynamique du liquide


porteur,
g : accélération due à la pesanteur,
Rω2 : (a) accélération centrifuge,
N : vitesse de rotation (en tr/min).

F:forc centrifuge
ω: vitesse angulaire de rotation
R: distance de l’axe de rotation
4. La constante de de sédimentation
Le taux ou coefficient de sédimentation lors de l'ultracentrifugation
d'une macromolécule. est calculé en divisant la vitesse constante de
la particule sédimente (en m/s) par l'accélération appliquée (en
m/s²).
La constante de Svedberg caractérise une particule dans un milieu
donné, elle est notée   :  S= (dR/dt) / ( w2.R) 

L'unité de la constante de sédimentation est le Sveberg : 1S = 10-13 sec

F:forc centrifuge
W: vitesse angulaire de rotation
R: distance de l’axe de rotation
Calcul de l’accélération lors d’une centrifugation
( force gravitationnelle relative FGR)
Dans une centrifugation, il faut connaître la force relative de centrifugation
(force de gravité relative, FGR, accélération) en "x g". Cependant pour une
vitesse de rotation donnée, chaque rotor a une FGR différente puisque que
le rayon de rotation est différent. Il faut donc être capable de convertir la
vitesse de rotation (RPM, rotations par minute) en FGR.

la formule mathématique de conversion. Celle-ci est:

g (FGR)= 1.119 • 10-5 x r x N2


où g (FGR) est la force relative de centrifugation, r est le rayon de
rotation du rotor (en cm) et N (rotations par minute, RPM) exprime la
vitesse de rotation.
Inversement, et c'est ce qui est généralement le plus utile
expérimentalement, on peut calculer la vitesse de rotation (en RPM) pour
atteindre une accélération donnée:
5. Appareillage
5.1 centrifugeuse
Une centrifugeuse est une machine équipée d’un axe de
rotation enfermé dans une enceinte et actionné par un moteur.
L’échauffement dû à la rotation peut être évité par un système de
réfrigération alors que le frottement avec les particules d’air dans
la chambre du rotor est réduit grâce à un système de création de
vide (pompe à vide).
Il existe différents types de matériels
1.Centrifugeuses de table: Les modèles les plus simples,
souvent appellées centrifueuses cliniques, permettent
d'atteindre de faibles accélérations (1000 à 3000 g) à des
vitesses de rotation relativement basses (moins de 3000
RPM). Certains modèles sont réfrigérés, certains autres non.
2.Centrifugeuses au sol: Ces appareils sont un peu plus complexes.
Elles permettent d'obtenir des vitesses de rotation de l'ordre de 30 000
RPM, donnant pour les plus petits rotors des accélérations d'environ
20 000 g. Tous les modèles sont réfrigérés. Ces centrifugeuses permettent
de centrifuger des relativement gros volumes. Certains rotors peuvent
même contenir quatre ou six bouteilles de 250 mL.
3.Ultracentrifugeuses: Ce sont des appareils complexes et coûteux qui
permettent d'atteindre des accélérations très élevées (jusqu’à 500 000 g) en faisant
tourner des rotors très rapidement (100 000 RPM). De telles vitesses de rotation ne
peuvent s'obtenir que sous pression très réduite. Les faibles pressions permettent
aussi d'éviter la surchauffe du rotor et de l'échantillon. Ces appareils doivent donc
être munis de pompe à vide et de systèmes de réfrigération. Les volumes sont
quelques peu limités, généralement on ne trouve pas de rotors pouvant contenir
plus d'une dizaine de tubes de 40 mL.
4.Microcentrifugeuses:
On a aussi développé des centrifugeuses spécialement conçues pour
les micro-volumes très souvent employés en biochimie moderne. Les
microtubes à centrifuger sont des petits tubes coniques
généralement de 1.5 mL fait de polypropylène et assez peu
dispendieux. Les centrifugeuses de ce type peuvent être réfrigérées
et atteindre des accélérations de l'ordre de 12-15 000 g. Les modèles
les moins couteux n'ont pas de contrôle de vitesse et ne sont pas
réfrigérés.
5.1 Centrifugeuses:
5.2 Les rotors
chaque rotor a une vitesse maximale à laquelle on peut le faire
tourner .
Il existe trois grands types de rotors
1.Les rotors à angle fixe (fixed angle):
 il sont faits de blocs de métal (aluminium,titane ) dans lesquels
sont creusés des puits servant de logements aux tubes de
centrifugation,ces puits inclinés avec un certain angle par rapport à
l’horizontale (de 15 à 35° selon les modèles).
Le rayon de ces rotors étant relativement court, il est assez facile
de les faire tourner rapidement.
 les particules sédimentent le long des parois des tubes et
s’accumulent sur les cotés du fond des tubes de centrifugation
Pour certains types de particules cela engendre une friction qu'elles
ne peuvent pas supporter et se brisent.
2.Les rotors à godets mobile (swinging buckets):

Dans ce système mobile, les godets disposés sur des crochets ou


sur un système mobile, ou sur un système à bascule se réorientent
quand débute la rotation du rotor et passent en position horizontale
sous l’effet de la force centrifuge.

Les particules peuvent ainsi sédimenter directement dans le fond


des tubes de centrifugation, sans heurter les parois des tubes .
3.Les rotors verticaux:
Ils sont moins répandus et peuvent être utilisés des centrifugations en gradient. Comme
les rotors à angle fixe, les rotors verticaux sont des blocs de métal résistants mais dont
les puits destinés à contenir les tubes sont verticaux .
L’avantage des rotors verticaux est leur capacité à atteindre de grandes vitesse de
rotation ,ce qui réduit considérablement les durées de centrifugation.
Centrifugeuses:
2.1 Les rotors
a/Manipulations et aspects pratiques
•Toutes centrifugation nécessite d’équilibrer parfaitement le rotors; les tubes
diamétralement opposés devant présenter une masse identique.
5.3 Types de centrifugation 
1. Ultracentrifugeuses analytiques:
On peut déterminer avec une grande précision la masse, la taille et le
coefficient de sédimentation des protéines et autres particules par
ultracentrifugation analytique . Cette technique exige un appareillage
(centrifugeuse, rotor, etc.) spécialisé à cette fin.

2. ultracentrifugation préparative
Le but de l’ultracentrifugation préparative est d’obtenir des préparations
purifiées de particules présents dans un milieu liquide, elle peut être
différentielle ou en gradient.
3. ultracentrifugation différentielle
Dans cette méthode, le tube de centrifugation est initialement rempli d’un mélange
homogène de la solution à centrifuger . Après centrifugation, on obtient
habituellement deux fractions :
un culot contenant les particules sédimentées et un surnageant ou se trouvent les
particules.
Les deux fractions sont récupérées en décantant le surnageant .
cette méthode peut aussi être utilisée pour purifier des particules dont la densité est plus
légère que celle du solvant (par exemple, les lipoprotéines);on parle alors
d’ultracentrifugation de flottation.
Exemple de l’ultracentrifugation différentielle : Fractionnement
cellulaire

 A 600g, pendant 10 minutes, on observe la


sédimentation du noyau et du cytosquelette.
 A 15 000g, pendant 5 minutes, on observe
la sédimentation des mitochondries, des
lysosomes et des peroxysomes.
 A 100 000g (ultracentrifugation), pendant
60 minutes on observe la sédimentation de la
membrane plasmique, des microsomes et des
grands polysomes.
 A 300 000g, pendant 2heures on observe la
sédimentation des ribosomes et des petits
polysomes.
 Ce qui reste à la fin c’est la fraction
hydrosoluble du cytosol.
4. ultracentrifugation en Zone
 Cette technique permet la séparation des particules selon leurs coefficients de
sédimentation.
 Dans ce type de centrifugation, la solution de macromolécules est déposée sous
forme de couche en haut d’un gradient de densité préparé auparavant
On utilise le saccharose est souvent utilisé pour la séparation des fraction
cellulaires, qui est visqueux et biochimiquement inerte pour former le gradient .
(Figure ultracentrifugation zonale).
l’ultracentrifugation en zones sépare les macromolécules de forme similaire
selon leur masse
 Pendant la centrifugation, chaque espèce se déplace à travers le gradient à une
vitesse largement déterminée par leur coefficient de sédimentation et donc migre
comme une zone.
 À la fin de l’expérience, la récolte des fractions se fait par l’insertion d’une
aiguille au fond du tube de centrifugation et on collectionne le contenu du tube
par un collecteur de fraction .
4. ultracentrifugation en Zone
4. ultracentrifugation en gradient de densité

Cette méthode de centrifugation, aussi connue sous le nom de centrifugation


isopycnique, sépare les macromolécules selon leur densité
 L’échantillon est dissout dans une solution concentrée d’une substance dense qui
diffuse relativement vite comme les sels CsCl et Cs 2SO4, et qui est subie à des hautes
vitesses de rotation
la technique préférée pour séparer des macromolécules qui possèdent une gamme
de densités.
Par exemple:
 acides nucléiques (plasmide vs ADN génomique et ARN total) -
 ribosomes et polysomes
 virus
 organites subcellulaires (microsome, mitochondries, …)
4. ultracentrifugation en en gradient de densité
ultracentrifugation en gradient de densité
Produits utilisés dans la constitution des gradients

Le saccharose ("sucrose") est très souvent employé pour la séparation des


fractions cellulaires.
le chlorure de césium (CsCl) et sulfate de césium Cs2SO4 couramment utilisé,
particulièrement dans la séparation des acides nucléiques.
Le tartrate de potassium KC4H5O6 : qui peuvent servir pour la purification de
virus labiles
Le Metrizamide™, (Nyegard), Le Ficoll™, Le Percoll™, sont des produits
comércialisés spécifiquement pour la constitution des gradients .
6.Applications de la centrifugation

dans l'environnement : dessiccation des boues pour le traitement des eaux


usées ;
 dans l'industrie alimentaire: séparation de la crème du lait
(écrémage),extraction des huiles et des matières grasses (extraction de l'huile
d'olive), extraction du miel (apiculture) ;
dans le domaine du nucléaire : pour enrichir l’uranium avec l'isotope léger 235U;

-en biochimie: la séparation du plasma ou du sérum sur lesquels seront pratiqués


différents dosages, la clarification des urines pour dosages spécifiques, etc.
 en hématologie: la détermination de l’hématocrite, les dosages des facteurs
plasmatiques de la coagulation.
 en immunohématologie: détermination des anticorps irréguliers, des groupes
sanguins, lavage des hématies pour les débarrasser du plasma, etc.
 en bactériologie: pour la cytologie de liquides de différentes organites,etc.
 en parasitologie: pour des épreuves de concentration des parasites,etc.
•Références bibliographiques
1. A ppareils et méthodes en biochimie et biologie moléculaire ;Bernard Hainque ,Bruno Baudin et philippe Lefebvre;edition
Médecine_sciences Flammarion ,2008,449 page .

2. Biochimie .Donald Voet,Judith G Voet , De Boeck superieur 2016,1784 pages.

3. Biologie cellulaire .Marc Maillet , Elsevier Masson 2006,618 pages.

4. Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation


Ultracentrifugation . Lucette BARDET . P 1 405
5. Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation
Décantation – Filtration.Par Jean HACHE. PE 1 415

Vous aimerez peut-être aussi