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Université Abou Bekr Belkaïd – Tlemcen

Faculté SNV – STU


Département de biologie

TECHNIQUES SPECTROSCOPIQUES EN BIOCHIMIE

TD 3 : DILUTIONS ET GAMME
D’ÉTALONNAGE
DR MEZOUAR DOUNIA
3ÈME ANNÉE LICENCE
BIOCHIMIE
2020 – 2021
EXERCICE 3

 Une gamme de 5 tubes contenant de 2 à 10 mg d'albumine par tube est réalisée partir
d'une solution étalon d'albumine à 10,0 g/L. Après 30 minutes à l'obscurité, les
absorbances sont lues à 540 nm contre le tube témoin de la gamme. En parallèle, un
tube contenant la solution du blanc d’œuf dont on veut déterminer la concentration en
protéines est préparée.
RAPPEL

 
Loi de Beer-Lambert A=
RAPPEL

 Gamme d’étalonnage
Pour un échantillon inconnu contenant un soluté X qui absorbe la lumière, de coefficient
d’extinction molaire (ε) inconnu.
On peut mesurer l’absorbance A de cet échantillon, par exemple A=1,3.
Mais on ne peut pas en déduire sa concentration (C inconnu) vu qu’ on ne connait pas (ε).

Comment faire ?
RAPPEL

 Nous allons utiliser des échantillons standards à des concentrations connues (C standard) et
nous allons par la suite, mesurer les absorbances de chaque concentration standard.

 Exemple :
 Echantillon standard 1 de concentration connue 2 mol/L → Absorbance mesurée A = 0,86 ;
 Echantillon standard 2 de concentration connue 1,2 mol/L → Absorbance mesurée A = 0,64
;
 Echantillon standard 3 de concentration connue 0,7 mol/L → Absorbance mesurée A =
0,43.
RAPPEL
Tracer la courbe standard, appelée courbe d’étalonnage Absorbance = f (concentration)

Les points devrait être alignés théoriquement car la relation qui lie l’absorbance à la concentration est
linéaire (A= a.x = εlc = l’équation d’une droite).
RAPPEL
 Remarque
La courbe d’étalonnage passe par 0 car on règle le spectrophotomètre en début de manipulation
de telle manière qu’il associe une absorbance nulle à un échantillon contenant une concentration
nulle en soluté absorbant → cet échantillon est un appelé « blanc ».
RAPPEL

Comment déterminer la concentration des protéines dans un


échantillon ?
RAPPEL

 La méthode la plus courante pour le dosage des molécules dont les protéines est la spectrophotométrie.
 Utiliser une méthode colorimétrique comme la technique de biuret dans laquelle l’absorbance
augmente proportionnellement avec la concentration en protéines.

Principe du dosage par la méthode de Biuret


 En milieu basique, le biuret va former avec les ions Cu2+ un complexe de couleur violette, qui sera dosé
à 540 nm.
 La liaison peptidique établie entre deux acides aminés est également capable, dans les mêmes
conditions expérimentales, de former un complexe avec les ions cuivriques.
RAPPEL
Réactif de
Biuret

Ajout de 4 ml du
réactif aux solutions
S1, S2, S3, S4 et S5

Eau distillée Solution


S1 S2 S3 S4 S5
standard
mère

Incubation pendant 30
minutes à l’obscurité
Réaliser cette
étape avec
l’échantillon X
RAPPEL
EXERCICE 3

1. Compléter le tableau ci-dessous.

Tube N° 0 1 2 3 4 5 Essai

Etalon 10g/L (mL) 0            

Solution blanc d’œuf (mL)              

Eau physiologique (mL) 1            

Réactif de Biuret (mL)             4

Albumine par tube (mg) 0 2 4 6 8 10  

A (540 nm )   0,102 0,206 0,301 0,404 0,498 0,215


EXERCICE 3

Tube N° 0 1 2 3 4 5 Essai

Etalon 10g/L (mL) 0  0,2 0,4  0,6  0,8  1   /

Solution blanc d’œuf (mL)  / /  /  /  /  /  1 

Eau physiologique (mL) 1  0,8  0,6 0,4  0,2  0  0

Réactif de Biuret (mL)  4  4  4  4  4  4 4

Albumine par tube (mg) 0 2 4 6 8 10  /

A (540 nm )   0,102 0,206 0,301 0,404 0,498 0,215


EXERCICE 3

0.6

0.5
f(x) = 0.05 x

0.4 La concentration en
protéines du blanc
Absorbance

0.3 d’œuf est 4,28 mg/ml

0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12
Concentrations (mg/ml)