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Biologie moleculaire

Plan du cours: niveau I


Chapitre 1 la structure des acides nucléiques
Chapitre 2: les génomes
Chapitre 3: Réplication,
Chapitre 4: transcription
Chapitre 5: traduction
Chapitre 6: les événements génétiques
Chapitre 7 : Les biotechnologies
Méthodes
• Cours magistraux
• Devoir et exercices en classe ou á la maison
• Travaux de groupes
• exposés
Objectifs pedagogiques
a la fin du cours nous devrons
1. Assimiler les grands principes de base
impliqués dans la transmission et la
réparation du matériel génétique, ainsi que
l’expression des gènes et sa régulation.
2. Acquerir les bases nécessaires à la
compréhension ultérieure des mécanismes
moléculaires de la physiopathologie ou de
l’action des médicaments
La biologie moléculaire

• Etude des processus de réplication, de


transcription et de traduction du matériel
génétique
• Ensemble des techniques de manipulation
d'acides nucléiques (ADN, ARN), appelées aussi
techniques de génie génétique
Objet : compréhension des mécanismes de
fonctionnement de la cellule au niveau
moléculaire.
• une discipline scientifique au croisement de la
génétique, de la biochimie et de la physique
Chapitre 1
Structure des acides nucléiques
Objectifs du chapitre
• Connaître la structure des acides nucléiques
– reconnaître les molécules simples et la nature des
liaisons qui les lient
– interpréter et manipuler les différentes
représentations de la structure primaire du DNA et
du RNA
– distinguer une extrémité 5’ d’une extrémité 3’ et
manipuler les unités de taille (kb, kpb, Mpb...).
Plan
• Structure primaire
– Les molecules simples
• Structure secondaire
Les acides nucleiques
• Les acides nucléiques sont des polymères dont
l’unité de base, ou monomère, est le
nucléotide.
• Sructure primaire
– Un acide nucléique est composé d’une base, d’un
sucre et d’un phosphate
2 familles de base
a noyaux puriques et pyrimidines
Les bases à noyaux Les bases à noyaux
puriques ( A/G) pyrimidiques (U, T, C
Ce type de noyau est à la base
Double noyau aromatique
de l’uracile (U) ou 2-6dioxyde
Ce type de noyau est à la pyrimidine (=O en 2 et 6), de
base de l’adénine (A) ou la thymidine (T) ou 2-
6-aminopurine (NH2 en 6dioxyde 5méthylpyrimidine
(=O en 2 et 6 et CH3 en 5) et
6) et de la guanine (G)
la cytosine (C) ou 2oxyde-
ou 2-amino, 6 4aminopyrimidine (=O en 2
oxydépurine (NH2 en 2 et NH3 en 4)
et =O en 6)
NH2
en 6

Noyau puriques Noyau pyrimidines


Desamination oxydative de la
cytosine??
Les modifications des bases???
Les sucres
(le ribose et le désoxyribose).

• Le ribose est un pentose dont tous les hydroxyles sont


orientés à droite (représentation de Fisher).
• Le désoxyribose, composant des acides
désoxyribonucléiques (DNA) est dérivé du ribose par une
réduction de la fonction alcool secondaire du carbone n°2.
NB: Le désoxyribose confère à cet acide nucléique une plus
grande stabilité propre à sa fonction de conservation de
l’information génétique
• Le désoxyribose est une forme beaucoup plus stable que
le ribose. Cette forme désoxy entraîne la stabilisation de
l’hélice.
Les phosphates
• Les phosphates permettent la solubilisation de
l’ADN dans l’eau
• Base + sucre = nucléoside
• Nucléoside + phosphate = nucléotide.
• Les phosphates permettent la polymérisation
des acides nucléiques (des nucléotides).
Les liaisons
Liaisons N-osidiques.
• Un nucléoside est donc formé d’une base et d’un sucre liés
par une liaison N-osidique.
• Dans un nucléoside, on numérote les atomes de la base
par des chiffres : 1, 2, 3, etc et les carbones du sucre par 1’,
2’,...

Liaison esther
•La liaison d’un nucléoside avec un phosphate se fait par une
estérification de la fonction alcool primaire (carbone n°5’) du
sucre et une des trois fonctions acides du phosphate.
L’ester obtenu est un nucléotide.
• Une liaison hydrogène
liaison de faible énergie entre deux atomes
attirés l’un vers l’autre pour des raisons
électrostatiques l’un étant riche en électrons
donc nucléophile et l’autre n’ayant que les
protons de son noyau donc électrophile
• Les bases azotées sont conventionnellement désignées
par une initiale et par une couleur :l’adénine par A et la
couleur verte, la guanine par G et la couleur jaune, etc...
• Chaque base peut entrer dans la structure d’un ou deux
nucléosides, selon que le sucre est un ribose ou un
désoxyribose.
• Chaque nucléoside peut être lié à un, deux ou trois
phosphates. On les désigne par des sigles
conventionnels : GMP pour guanosine monophosphate,
CDP pour cytidine diphosphate, ATP pour adénosine
triphosphate, etc...
• Les acides nucléiques sont formés par une
polycondensation de nucléotides AMP, CMP, GMP et
UMP pour les acides ribonucléiques, dAMP, dCMP,
dGMP et dTMP pour les acides désoxyribonucléiques.
Structure secondaire de l’ADN
• L’ADN est formé de deux brins antiparallèles
dont les bases sont hydrophobes.

• Les couples de bases (A-T et C-G) sont


maintenus grâce à des interactions
hydrogènes.
• Ces interactions permettent l’association et la
structure en hélice
Structure secondaire de l’ADN
Type Nombre de Sens de Angle entre 2
bases par rotation sucres
tour
B 10 Dextrogyre 36°
A 11 Dextrogyre
Z 12 Lévogyre
ADN-B : forme d'ADN la plus
commune
• hélice droite,
• des plateaux de base perpendiculaires à l'axe
• 10,5 paires de bases par tour (21 nucléotides)
• rotation de 36 ° entre deux sucres
ADN-A : forme d'ADN spécifique à la
transcription
l'ARN ne peut adopter que la conformation de
type A, lors de la transcription, il stimule un
transfert de l'ADN du type B vers le type A
• Plateaux de base très inclinés, une position
tangentielle des sucres
• 11 paires de bases par tour
• 32,7 ° entre deux sucres.
ADN-Z
•  Son rôle est de favoriser l'interaction des bases avec
les protéines régulatrices.
• C'est une hélice gauche. Il est caractérisé par des
plateaux peu inclinés (9 ° à peu près), et une position
alternative des sucres en radiale et tangentielle
• présente 12 paires de bases par tour soit 30 ° entre
deux sucres.
• Le passage de l'ADN-B en ADN-Z est favorisée par la
présence de multiples cytosines au sein des
promoteurs.
• L’ADN est il circulaire ou lineaire?
Le surenroulement
• Le surenroulement entraîne un compactage de l’ADN.
Rôle
• L’ADN est beaucoup plus compact.
• Le surenroulement négatif aide à la séparation des brins
alors que le surenroulement positif resserre les brins.
• Il régule l’expression génique
– en permettant ou non la transcription de la partie
surenroulée.
Pour retirer cet enroulement, il faut libérer un brin
devoir
• Les composantes des acides nucleiques
• La structure en double helice
• Le nucleosome, la chromatine, les
chromosomes
• Possibilites de structures terciaires de l’ARN
• L’appariement des bases de l’ARN est il aussi
strict que l’ADN
Enzymes agissant sur les acides nucleiques

1. Les enzymes de restriction

2. Les outils enzymatiques autres que les


enzymes de restriction 
Enzymes de restriction
• Ce sont des endonucléases produites et
extraites de bacteries
• Elles coupent les liaisons phosphodiester 3’-5’
des deux brins de l’ADN en des sites
specifiques
• Les extremites d’ADN generes par un clivage
enzymatique peuvent spontanement se
reassocier
Nomenclature des enzymes de restriction
Leur nom comporte plusieurs lettres (3 ou 4).
• La première lettre: majuscule, elle correspond au genre de la
bactérie
• La seconde lettre et la troisième lettre (minuscules) correspondent
à l’espèce de la bactérie
• On peut avoir une quatrième lettre écrite en majuscule
correspondant à la souche bactérienne.
• un chiffre romain indique l’ordre de caractérisation de ces
enzymes.
• Exemples:
– Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB site reconnu: G / AATTC
– Sma I Extraite de Serratia marcescens site reconnu: CCC / GGG
– Pst I Extraite de Providencia stuartii site reconnu: CTGCA / G
Les classes d’enzymes de restriction
• Enzymes de types II: présentent un site de
reconnaissance (souvent palindromique) et un site
de coupure identique ou proche du site de
reconnaissance
• Les enzymes de type I reconnaissent des séquences
sur l’ADN sans aucune symétrie. Ils coupent 1000 à
5000 paires de bases plus loin.
• Les enzymes de type III présentent également un site
de reconnaissance mais coupent une vingtaine de
nucléotides plus loin.
Types de coupures réalisées par les enzymes
de restriction
• Deux types de coupures:
– la coupure à bouts francs
– la coupure à bouts collants (extremites adhesives)
• La coupure à bouts francs aboutit à une coupure
au milieu de la séquence palindromique.
• La coupure à bouts collants (ou à extrémités
adhésives) correspond à une coupure qui se fait
de part et d’autre du centre de symétrie.
• 5’-GG↓CC-3’
• 3’-CC ↑GG-5’
Utilisations des enzymes de restriction

• Fractionnement de l’ADN en multiples


fragments
• Préparation d’un fragment d’ADN d’un gène
donné
• Recherche des mutations dans le génome.
• Recherche les méthylations de bases dans
l’ADN des cellules eucaryotes
Enzymes de restriction compatibles v/s
isoschizomeres
• Deux enzymes de restriction sont dites compatibles
quand elles génèrent après digestion des fractions
aux extrémités cohésives complémentaires. Ces
fragments peuvent être facilement ligaturés.
• Notion d’isoschizomères
des enzymes de restriction différentes peuvent
reconnaître des mêmes sites spécifiques. Les
isoschizomères fournissent souvent après clivage
enzymatique des fragments dont les extrémités sont
différentes. 
Les outils enzymatiques autres que les
enzymes de restriction
1.  Les enzymes coupant l’adn.
– La DNase
– La nucléase S1
2. Les enzymes assurant la ligature.
– Les ligases
3. Les enzymes enlevant ou ajoutant des groupes phosphates.
– Enzymes enlevant des groupes phosphates
– Enzymes ajoutant des groupements phosphates
4. Les enzymes recopiant les acides nucléiques.
– Les enzymes recopiant un adn en adn
– Les enzymes recopiant un arn en un adn
– Les enzymes recopiant un adn en un arn 
Les enzymes coupant l’ADN
• La Dnase
– Endonucléase: coupe l’ADN double et simple brin
– coupures au hasard,
• La nucléase S1
– Cette enzyme extraite d’un champignon, n’attaque
que l’ADN simple brin.
Les enzymes assurant la ligature.
Les ligases
• Capables de lier par une liaison ester un
fragment avec un groupement phosphate en
5’ et un groupement OH en 3’
• Nécessite de l’energie
• Effectue des ligatures sur fragments d’ADN
avec bouts francs ou des bouts collants
• Elles sont extraites de bactéries.
• Il existe ADN et ARN ligases.  
Les enzymes enlevant ou ajoutant des
groupes phosphates
• Enzymes enlevant des groupes phosphates
• Ce sont les phosphatases.
• Elles permettent d’enlever le groupement
phosphate situé en 5’ d’une chaîne d’ADN.
• extraites de bactéries ou d’origine animale
• Enzymes ajoutant des groupements phosphates
• Les kinases permettent de fixer un groupement
phosphate en présence d’ATP.
• Ces kinases sont extraites de bactéries.
Les enzymes recopiant les acides nucléiques

• Propriétes générales
• Elles synthétisent le nouveau brin dans le
sens 5’à3’.
• Cette synthèse s’effectue de manière
complémentaire et antiparallèle.
• Elles nécessitent la présence de nucléosides
triphosphates (NTPs) ou de désoxynucléosides
triphosphates (dNTPs). 
Les enzymes recopiant ADN en ADN
• Ce sont des ADN polymérases ADN dépendantes.
• Elles ne sont pas capables de synthétiser le brin nouveau
d’ADN sans la présence d’une amorce d’acide nucléique.
• Toutes les ADN polymérases possèdent les
caractéristiques suivantes:
1. Elles ont besoin d’une amorce avec une extrémité 3’-OH
libre.
2. La chaîne nouvelle d’ADN est synthétisée dans le sens 5’à3’.
3. La chaîne nouvelle est complémentaire de la chaîne matrice
d’ADN et antiparallèle.
Les enzymes recopiant ARN en ADN
Rétrotranscriptase ou transcriptase inverse

• Surtout présente dans les rétrovirus (virus à ARN).


Elle permet de fabriquer à partir d’un ARN
messager (mARN) un ADNc
propriétés
- C’est une ADN polymérase qui synthétise le
nouveau fragment dans le sens 5’à3’.
Elle est ARN-dépendante.
Elle est dépourvue d’activité exonucléasique 3’à5’,
Necessite une amorce
Les enzymes recopiant ADN en ARN
• Les ARN polymérases réalisent des transcriptions de l’un des
deux brins d’ADN en un brin d’ARN.
• Elles peuvent être extraites des bactéries
• Elles synthétisent le brin nouveau dans le sens 5’à3’
• Elles n’ont pas besoin d’amorce pour commencer la synthèse
(à la différence des ADN polymérases).
• Elles nécessitent des ribonucléosides triphosphates (ou
NTPs) et également (comme les autres polymérases) des
ions Mg2+.
• les ARN polymérases ne peuvent démarrer la transcription
que si l’ADN à transcrire possède le promoteur spécifique
correspondant.
Dénaturation
• Processus qui conduit à transformer un double brin d'ADN en
deux simples brins, en rompant les liaisons hydrogène entre les
bases azotées (processus reversible)
– pH (des concentrations ioniques élevées, des agents alcalins,...)
– température,
– certains solvants,
Paramètres influençant la dénaturation
• La composition en bases GC / AT.
• la composition du milieu : une augmentation de sels monovalents
élève le Tm. Une augmentation d’urée permet de diminuer le Tm.
• Un pH extrême diminue le Tm.
Denaturation(suite)!!
• Quand on dénature de l’ADN, on change ses
propriétés.
• Sa densité augmente ; en centrifugation isopycnique,
l’ADN simple brin est au niveau de l’ARN.
• Les colonnes d’hydroxyapatite (phosphate de calcium)
retiennent l’ADN double brin et laissent passer le
simple brin.
• Les membranes de nylon ou de nitrocellulose
retiennent le simple brin et laissent passer le double
brin
Hybridation moléculaire

• L’hybridation moléculaire désigne l’association qui peut avoir


lieu entre deux acides nucléiques simples brins de séquences
complémentaires et qui conduit à la formation d’un double brin
ou duplex.
• établissement de liaisons hydrogènes spécifiques
• deux liaisons entre l’adénine (A) et la thymine (T) (ou l’uracile U)
• trois entre la cytosine (C) et la guanine (G).
• La formation et la stabilité des duplex dépendent de:
– la composition en bases
– longueur des duplex
– La complexité de la séquence.
Hybridation (suite)
• L’hybridation est à la base de nombreuses
techniques de biologie moléculaire
• Le brin qu’on connaît a est une sonde,
• l’autre brin, constitue la cible.
A retenir pour la premiere partie
• Structure primaire des acides nucleiques
• Les 3 types de liaison liaisons
• Les enzymes de restrictions definition et role
• Categorisation des autres enzymes
• Hybridation / denaturation: notion de sonde
et de cible
Dosage des acides nucleiques
methodes spectrophotometriques
• La plus précise, la plus communes, la plus rapide et la
plus simple
• Se base sur l’absorbance des acides nucléiques par
l’ultraviolet.
• Les acides nucléiques ont la propriété d’absorber les
rayons ultraviolet a une longueur d’onde de 260 nm.
• La concentration d’un échantillon d’un acide nucléique
donne est obtenu par la relation suivante:
• Concentration micromol/mililitre= DO (densite optique
260 nm x 50 x facteur de dilution)
Dosage des acides nucleiques
methodes spectrophotometriques ??
• La plus précise, la plus communes, la plus
rapide et la plus simple
• Se base sur l’absorbance des acides nucléiques
par l’ultraviolet.
• Les acides nucléiques ont la propriété
d’absorber les rayons ultraviolet a une
longueur d’onde de 260 nm.
Dosage

• Les bases absorbent les UV vers 260 nm. (A :


259 nm ; G : 253 nm ; C : 271 nm)
Extraction de l’AND et l’ARN
purification
separation
L'extraction des Acides nucléiques
• Technique permettant d'isoler un acide nucleique
d’une cellule pour des recherches de biologie
moléculaire,
1. Lyse des cellules
2. Elimination des protéines
3. Elimination d’ autres acides nucléiques (ARN)
4. Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool
NB: Il existe aujourd'hui des kits commerciaux
permettant de réaliser rapidement ces extractions à
l'aide des réactifs prêts à l'emploi.
Purification des acides nucleiques
• Pour les cellules eucaryotes,
• On a trois composants principaux : le noyau, le
cytoplasme et les mitochondries, Pourquoi?
La séparation des acides nucléiques des
protéines?
• On dénature les protéines avec : guanidine,
perchlorate de lithium ou uree
• la séparation grâce à un solvant organique
(phénol, chloroforme).
separation
La concentration par précipitation
• On prépare une solution d’acides nucléiques
avec l’éthanol et un sel (Na+Cl-).
• Le sel va rentrer en compétition avec les
molécules d’eau et l’éthanol.
• Les acides nucléiques vont alors précipiter et
on obtiendra une solution relativement pure.
Séparation des acides nucléiques.

• On fait une digestion enzymatique de l’ADN ou


de l’ARN par une DNase ou par une RNase.
La centrifugation à l’équilibre ou
centrifugation isopycnique
• On utilise une solution saline qui forme un
gradient de densité
• les molécules vont descendre ou monter pour
se mettre au niveau de leur densité.
• L’ARN est plus dense que l’ADN
• L’ADN est plus dense que les protéines.
• Pour voir les acides nucléiques, on ajoute un
colorant
Centrifugation a l’equilibre
electrophorese
• Technique d'analyse et de séparation
• basées sur la charge électrique et la taille des
molécules.
• Des particules ou des molécules, en solution migrent
sous l'effet d'un champ éléctrique si elles sont
chargées électriquement.
• On peut ainsi analyser et purifier dans un milieu gélifié,
l'ADN, l'ARN et les protéines.
• Application: identification de gène, empreintes
génétiques
Marquage des acides nucléiques
Les outils du génie génétique
Marquage des acides nucléiques
Marquage des acides nucléiques
• Le marquage le plus simple est le marquage
radioactif.
• Realiser avec différents isotopes. 
• Le plus classique est le 32P, d’une demi-vie de
14 jours
– Le 35S : sa demi-vie est de 90 jours, Il est moins
sensible mais plus précis que le 32P.
– Le 3H, sa demi-vie est de 12 ans
marquage
• On peut marquer un acide nucléique en lui
ajoutant un phosphore marqué
radioactivement sur une extrémité.
• On fait d’abord agir une phosphatase pour
enlever le phosphore non marqué.
• On fait ensuite agir une kinase avec de l’ATP
marqué
• Le marquage se fera en 5’.
Les outils du genie genetiques
• Les enzymes
• Les vecteurs
– Les plasmides
– Les phages
– Les systemes hybrides
• Les oligonucleotides
– Clonage
– ADNc
Bref rappel sur les enzymes
ADN recombinant
1. S’obtient en inserrant par recombinaison
– l’ADN etranger dans un vecteur
– vecteur qui se replique de façon autonome
2. Nouvelle combinaison de
– l’ADN d’un génome donneur (qui peut être de
n’importe quel organisme)
– avec l’ADN d’un vecteur qui peut être d’origine
complètement différente.
Principe
VECTEUR / transporteur
Organisme donneur d’ADN.
Extraction et coupure de l’ADN C’est un fragment d’ADN
en fragment contenant de un à capable de réplication
plusieurs fragments d’intérêt. autonome

insertion individuelle de chaque


fragment d’ADN dans une molécule
de vecteur.

Obtention de l’ADN
recombinant
clonage
• une technique de biologie moléculaire qui
consiste à
• isoler un fragment d'ADN et à
• le multiplier à l'identique
• en l'« insérant » dans une molécule d'ADN
« porteuse » appelée vecteur permettant son
amplification
Les vecteurs

Plasmides
Phages
Systemes hybrides
Caracteristique d’un vecteur de clonage

• Il comporte:
• Une origine de replication
– pour assurer la multiplication autonome du
vecteur
• Une region (site multiple de clonage)
– contenant nombreux sites multiple de clonage
• Un ou 2 marqueurs de selection
– Genes de resistance a des antibiotiques
• Origine de replication ou ori
– est une séquence unique d'ADN permettant l'initiation de la
réplication
• Genes de selection
– favorisent la croissance du tissu produit par la cellule dont le
génome a été génétiquement modifiée
– provoquent la mort des cellules ou organismes
génétiquement modifiés dans certaines conditions
• Un site de clonage multiple
– est une séquence d’ADN contenant plusieurs sites reconnus
par des enzymes de restriction.
Plasmides
• Molecules d’ADN
– circulaire, extrachromosomiques,
– presente chez procaryote, qlq eucaryotes.
– multiplication independante au sein des cellules hotes
– transmission reguliere au cour de division
– Controle autonome du nombre de replique
• 1 a 60 copie de plasmide par cellule
• Represente 0.5 a 3 % du genome bacterien
• Porte des genes absents du chromosome
• Vehicule ideal pour introduire des genes ds la
bactérie
Les plasmides(suites)
• Il faut connaître les
parties indispensables
pour utiliser le plasmide
comme vecteur.
Vecteur viraux/bacteriophage
• Les bacteriophages autorisent le clonage de grands
fragments d’ADN
– 1/3 de ADN peut etre remplace par un ADN etranger
• Les vecteurs phagiques utilises pour le clonage sont
derives du phage lambda
• Aux extremites du phage il y a des sequences appelees
sites cos:
– necessaires pour l’integration du phage dans le genome de
l’hote(durant la phase de lysogenie)
• Les ADN etrangers peuvent etre introduits dans des
bacteriophages apres elimination de la partie centrale
Les systèmes hybrides.
Les systemes hybrides
1. Plasmide + origine de M13
2. Les cosmides : plasmide + extrémités cos
(cohésives) de λ.
3. YAC (yeast artificial chromosome) ou
chromosome de levure
Les cosmides : plasmide + extrémités cos (cohésives) de λ.

• Les cosmides sont des vecteurs hybrides portant à la fois :


• Des séquences d’origine phagique permettant leur
encapsidation in vitro (séquence cos).
• Des séquences d’origine plasmidique : gène de résistance
à un antibiotique et séquence permettant au plasmide de
se répliquer dans une bactérie comme un simple
plasmide (séquence ori).
• Ceci permet de se dispenser des régions essentielles de
l’ADN du phage et de construire des ADN recombinants
portant jusqu’à 45 kb d’ADN étranger.
Chromosome artificiel bacterien ou BAC/

• Construits a partir de plasmide, caplable


d’ingere de tres grands fragements d’AND
• Utilise comme vecteur
• Porte des insert d’AND de 300 kpb
• Introduits dans les bacteries par
electroporation
– (introduction de l’AND dans la cellule avec un
champ electrique applique sur la membrane)
Vecteurs pour levures
• La levure est le modele d’eucaryote le plus
elaboree pour les techniques d’AND
recombinant
– Possede un plasmide naturel; plasmide 2 microns
• Le Vecteurs le plus simple
– Plasmides bacteriens avec insertion de fragement
d’AND de levure
Transfert et expression des genes procaryotes

• Organisme transgenique:
– Tout organisme ayant integre dans son genome un
fragment d’ADN etranger
• Le gène etranger est un transgène
• 2 systemes d’expression les plus utilises en
experimentation de laboratoire:
– E. coli
– Levures
• Ils permettent la production de proteines
recombinantes: insuline, ho de croissance,
Banque d’ADN
• Une banque d'ADN est une POPULATION de vecteurs con
tenant des fragments d'ADN divers représentatif d'un typ
e cellulaire, d'un génome, d'un stade particulier de dével
oppement. Elle est caracterisee par
•  le type de vecteur
• la nature des inserts (ADN genomique, ADNc),  origine
• le pourcentage de vecteurs possédant un insert
• la taille moyenne des inserts
• la taille de la banque c.a.d la quantitéde clones /
ml de banque
Les banques d’AND
banque d’AND genomique
• Banque d’AND genomique
– Constituee d’un ensemble de fragment d’AND
– representatif d’un genome entier ou d’une fraction du genome
• Pour constituer la banque
– AND genomique coupe(enzyme de restriction)
– Les fragments obtenus inserre de facon aleatoire dans les vecteurs
de clonage
– Info genetique dispersee dans differente copies du vecteurs
• Differentes banques
– Petits genome->vecteurs plasmidique ou phagique
– BAC: plus employes car grande taille des fragments qu’ils peuvent
integres
Banques d’AND complementaire
• Constituee a partir d’AND complementaire
• ARNm poit de depart de la banque
• Pour synthetiser l’ADNc a partir de l’ARNm on
utilise la transcriptase inverse de retrovirus
• L’enzyme utilise comme amorce un oligonucleotide
polydt complementaire de la queue poly A
• On obtient un heteroduplex ARN/AND
• Pour cloner correctement le fragment d’ADNc il est
souhaitable que ses extremites soit cohesives
Choix de banque
AND genomique ou complementaire
• Depend des questions a resoudre
• ADNc
– Recherche de sequence codante d’un gene qui
s’exprime specifiquement dans un tissu
• AND genomique
– Connaitre la structure complete du gene (region
codante et non codante)
un crible génétique
• Une technique qui permet d'identifier les
gènes impliqués dans un phénotype donné.
• Elle consiste en 3 étapes :
1. production de nombreuses mutations
2. sélection des individus présentant un
phénotype mutant
3. identification des gènes mutés responsables
du phenotype

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