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ANALYSES BIOLOGIQUES
ET
MICROBIOLOGIQUES

4 Crédits

Responsable: Dr RANDRIANIERENANA Ando


INTRODUCTION

Il est capital de connaître les risques liés à l’utilisation des produits


et leur impact sur la santé publique.

Afin de garantir un produit sain et la prise en compte afférant à


chaque produit, il est indispensable de passer par l’analyse du
produit.

Les analyses biologiques et microbiologiques permettent, de


vérifier l’absence de risque pour la santé du consommateur, lors de
l’utilisation d’un produit. Elles contribuent à assurer l’innocuité du
produit (absence d’action nuisible = inoffensif = ne cause aucun
dommage).
L’objectif de ces analyses est de rechercher ou de quantifier un
certain nombre de germes dangereux pour la santé (germes
pathogènes).
DENOMBREMENT DES GERMES

I-Introduction
Les analyses microbiologiques permettent de mettre en évidence et
de quantifier les germes présents dans un produit.
ces analyses ne sont pas seulement qualitatives mais aussi
quantitatives.
il est donc important de connaître la charge microbienne du
produit (quantification des germes présents).
selon les types de germes présents et leur nombre respectif,
l’analyse en laboratoire permet de valider que le produit correspond
aux exigences et respecte la réglementation en vigueur.

La présence de germes dans un produit est fréquente. Cependant,


tous les germes ne sont pas dangereux pour la santé humaine et
certains ne sont dangereux qu’à une certaine concentration.
l’analyse microbiologique des produits permet de réagir
rapidement en cas de contamination dangereuse.
II- Prélèvement (échantillonnage)
La première étape du dénombrement des germes est constituée
par la préparation de l’échantillon

L’échantillon doit être représentatif du produit que l’on veut


contrôler Le prélèvement ne doit pas modifier ses
caractéristiques microbiologiques
il doit être effectué dans des conditions d’asepsie
satisfaisantes pour ne pas apporter des microorganismes autres que
ceux du produit.
tous les matériels utilisés doivent être stériles

Si le produit peut être considéré comme uniforme, l'échantillon


peut être prélevé dans n'importe quelle partie du contenant.

Si, toutefois, le produit n'est pas physiquement uniforme, il peut


être nécessaire de rétablir l'uniformité du produit avant de procéder
au prélèvement
On peut mélanger un liquide séparé, ou dissoudre un dépôt
solide dans un liquide en chauffant légèrement et en agitant. Ces
interventions sont difficiles à pratiquer sur de grands récipients et
on ne les tentera pas sans avoir une connaissance suffisante des
propriétés du contenu.

III- Les limites ou critères microbiologiques


analyse microbiologique d’un bioproduit résultats
comparaison avec des critères microbiologiques qui
fixent des limites réglementaires ou normatives.

une norme = un document descriptif, élaboré par consensus et


approuvé par un organisme de normalisation reconnu (exemple
l’ISO = International Organization for Standardization).

Chaque limite, fixée par la réglementation ou par une


norme, définit, en fonction des bioproduits, l’acceptabilité
du bioproduit :
-- absence ou présence d’un type de micro-organisme par unité de
masse ou de volume ;
-- nombre de micro-organismes d’un type donné par unité de
masse ou de volume.

Conditions et modalités de l’acceptabilité du bioproduit :


Si
- n : nombre d’unités de l’échantillon prélevées au hasard dans un
lot et analysées pour répondre aux exigences définies
- m: représente des concentrations acceptables de
micro-organismes .

Dans un plan à deux classes: m sert à distinguer les unités de


qualité satisfaisante de celles qui sont de qualité non satisfaisante.
Dans un plan a trois classes, m sert a distinguer les unités de
qualité satisfaisante de celles qui sont de qualité acceptable
une valeur limite ≪ m = M ≫ dans plan a deux classes
- M : représente des concentrations inacceptables de micro-
organismes produit insalubre ou avarié.

M sert à distinguer les unités de l’échantillon de qualité acceptable


de celles qui sont de qualité non satisfaisante.
Si la valeur d’une unité d’échantillonnage > M le lot dont provient
l’échantillon est inacceptable

- c : représente le nombre maximal permis d’unités prélevées de


qualité acceptable.
Si le nombre d’unités de qualité acceptable > c le lot dont
provient l’échantillon est inacceptable.

Les tableaux d’interprétation prévoient donc :


-- le nombre d’unités n de l’échantillon ;
-- le nombre d’unités c de l’échantillon pouvant être comprises
entre m et M
-- des limites sous deux formes :
・ plan a trois classes : deux valeurs limites m et M ,
・ plan a deux classes : une valeur limite m = M .

Plan d'interprétation à deux classes concentration de


microorganismes par
0 m=M unité de masse ou de
volume du produit
classe 1 classe 2

Deux classes sont définies par unité de l’échantillon:


-1ere classe : le résultat obtenu < m (=M) satisfaisant
-2e classe : le résultat obtenu > m (=M) non satisfaisant ou
corrompu
-Si toutes les unités n de l’échantillon ont une valeur ≤ m,
l’échantillon et le lot sont validés (satisfaisants).
Si une unité de l’échantillon a une valeur > m l’échantillon
et le lot sont refusés (non satisfaisants), quel que soit le résultat des
autres unités de l’échantillon.

Si m (= M) = 0 (cas de Salmonella par exemple) absence du


micro-organisme (pathogène) dans le volume (masse) de
bioproduit analysé.

Si la recherche microbiologique met en évidence la présence


dans le bioproduit d’au moins un micro-organisme recherché, le
bioproduit est considéré comme corrompu (non satisfaisant)
il est rejeté ainsi que le lot dont il est issu.
Plan d'interprétation à trois classes concentration de
microorganismes par
0 m M unité de masse ou de
volume du produit

classe 1 classe 2 classe 3

Trois classes sont définies par unité de l’échantillon:


-- 1ere classe : le résultat obtenu < m satisfaisant
-- 2e classe : le résultat obtenu compris entre m et M acceptable
-- 3e classe : le résultat obtenu > M non satisfaisant

Si une seule unité de l’échantillon a une valeur >M l’échantillon


et le lot sont refusés (corrompus) quel que soit le résultat des autres
unités de l’échantillon.
Si toutes les unités de l’échantillon ont une valeur <m, l’échantillon et
le lot sont validés (satisfaisants)
Si n1 unités de l’échantillon sont <m et n2 unités sont comprises
entre m et M le paramètre c permet alors de conclure :
.si n2 ≤ c l’échantillon et le lot validés comme acceptables
.si n2 > c l’échantillon et le lot sont refusés comme corrompus.

Quelques critères microbiologiques (en UFC.g-1):

Produit de Catégorie 2
Préparations pour application locale ou pour administration
dans les voies respiratoires
- Bactéries aérobies viables : < 102
- Champignons : < 102
- Entérobactéries : < 102
- Pseudomonas aeruginosa : absence
- Staphylococcus aureus : absence
Produit de Catégorie 3B
Préparations pour administration orale contenant
des matières premières d’origine naturelle, lorsqu’un
pré-traitement antimicrobien est impossible et que les matières
premières peuvent avoir une contamination tolérable (103 UFC/g ou
/10 ml)
- Bactéries aérobies viables : < 104
- Champignons : < 102
- Entérobactéries : < 102
- Staphylococcus aureus : absence
- E. coli : absence
-Salmonella : absence pour 10 g ou 10 mL
IV- Méthodes de dénombrement :
A-Méthodes directes :
*Le comptage direct des cellules se fait au microscope à l’aide d’un
hématimètre appelé Lame de Thoma
(c’est une lame munie au centre d’un quadrillage de dimensions
bien déterminées)
* Epifluorescence :
Les bactéries sont colorées par un fluorochrome (Orange d’acridine
ou Erythrosine), puis observées au microscope en lumière UV.
Cette méthode permet de compter sélectivement les bactéries
vivantes fluorescentes à une couleur différente des cellules mortes.
*Compteur de particules :
Cet appareil réalise automatiquement le dénombrement des
particules ou cellules en suspension dans une solution, grâce aux
modifications de résistances électriques qu’elles provoquent à leur
passage à travers un orifice calibré.
B-Méthodes indirectes :
Le dénombrement se base sur l’évaluation de la biomasse
produite après culture et incubation dans des conditions
favorables soit par :
*Mesure de la masse après culture sur milieu de culture liquide :
La biomasse peut être évaluée par pesée du poids sec après
filtration et séchage) ou par mesure de la densité du trouble (DO
au spectrophotomètre: la valeur de la DO est toujours
proportionnelle à la quantité de biomasse dans le milieu)
* Mesure de l’activité des bactéries, en suivant la cinétique de
disparition d’un substrat ou celle de l’apparition d’un produit final.
*Mesure du nombre de bactéries :
- Dilution et dénombrement en milieu de culture solide
-Estimation du nombre le plus probable (NPP)

C-Différence entre les méthodes directes et indirectes :


Méthodes directes : comptent directement les cellules, leur
résultat est rapide, mais peuvent compter aussi bien les cellules
mortes que les cellules vivantes.

Méthodes indirectes : ne comptent que les cellules viables et


culturables dans un milieu de culture mais demandent du temps
(minimum 24h).

Selon le but recherché et la précision du dénombrement requise,


on choisit l’une ou l’autre des méthodes.

V- Techniques de dénombrement indirect


Le but des techniques de numération (ou dénombrement) est de
déterminer la concentration en bactéries contenues dans un
produit initial.
Dénombrer les bactéries = donner le nombre de bactéries par
unité de volume, très souvent par ml de culture analysée.
Les techniques de numération des germes nécessitent une ou
plusieurs dilutions décimales (au dixième).
Elles peuvent se réaliser :
• en milieu solide :
.en surface
.ou dans la masse
• en milieu liquide.

A- Numération en milieu solide


1. Principe général
Les bactéries à dénombrer présentent dans l’inoculum sont
ensemencées soit à la surface, soit dans la masse d’un milieu gélosé
(germes anaérobies)
Chaque bactérie isolée donne naissance à une colonie ou UFC
(unité formant colonie).
2. Techniques
Au moins deux boîtes sont ensemencées pour chaque dilution.
Pour un même produit: Une seule pipette stérile de 1 mL pour
ensemencer toutes les boîtes si elles sont ensemencées de la
dilution la plus grande à la dilution la plus petite (du plus diluée au
plus concentrée). Exemple : 10-3, 10-2 puis 10-1

a. En surface
Le milieu gélosé est pré-coulé dans des boîtes de Pétri
Ensemencement :
Le dénombrement en surface s’effectue sur 0,1 mL de dilution.
• Homogénéiser la dilution à prélever (la plus grande).
• Prélever l’inoculum (volume précis) et le déposer au centre de la
surface de la gélose.
• Étaler à l’aide d’une pipette râteau ou d’un étaleur plastique le
volume sur toute la surface du milieu.
b- Dans la masse avec ou sans double couche
Les milieux gélosés adéquats sont liquéfiés et maintenus en
surfusion à 65 °C.
20 mL de milieu par boîte de Pétri en une seule couche ou avec:
- 15 mL pour la 1ère couche
- 5 mL pour la 2nde couche

Ensemencement dans la masse


Le dénombrement dans la masse s’effectue sur 1 mL d’inoculum
par dilution.
• Homogénéiser la dilution à prélever (la plus grande).
• Prélever 1 mL et déposer la dilution dans le fond de la boîte en la
répartissant en gouttes.
• Couler aseptiquement environ 15 mL de milieu gélosé maintenu
en surfusion mais légèrement refroidie (à une température pour
laquelle le tube peut être tenu dans la main sans se brûler,
permettant la survie des micro-organismes et pour laquelle la
gélose ne se solidifie pas (environ 45°C).
• Homogénéiser en imprimant à la boîte de Pétri fermée des
mouvements circulaires (en dessinant des 8 sur la paillasse).
• Laisser refroidir la gélose sans la bouger.

Réalisation de la double couche


Dans certains cas, quand une bactérie peut donner des colonies
envahissantes (très grosses colonies), on peut recouvrir le milieu
solidifié (refroidi) d’une couche de ce même milieu (5 mL)

Incubation
La température d’incubation sera indiquée sur le compte-rendu ou
sur un papier placé sur les boîtes et est variable suivant les micro-
organismes à dénombrer (exemple : coliformes totaux à 30°C,
coliformes thermotolérants à 44°C).

c- Lecture et interprétation
Le comptage des UFC ne doit pas être réalisé au hasard mais de
manière méthodique Il est conseillé de délimiter des
ensembles au marqueur sur le fond de la boîte de Pétri (exemple:
toutes les 20 UFC comptées)

Il faut que le nombre d’UFC soit significatif (au moins 15 et au plus


300).
Les résultats seront rendus en écriture scientifique avec deux
chiffres significatifs.

Exemple Volume Nombre UFC


inoculum
1ml 1ère boite 2ème boite

Produit pur >300 >300


Dilution 10-1 304 287
Dilution 10-2 26 38
-3
- Cohérence intra-dilutions (des valeurs voisines).
- Cohérence inter-dilutions (on attend un facteur 10).
-On prend la dilution pour laquelle il y a le moins d’incertitude.
On tient compte ici de la dilution 10-1 : donc 295UFC/mL à 10-1

La concentration bactérienne dans le produit pur est de 3,0.10


3
UFC/ mL.

B-Numération en milieu liquide


1. Principe général
La seule manière de savoir si un micro-organisme est présent ou
non dans l’inoculum par les techniques en milieu liquide sera de
le mettre en évidence par un de ses caractères (exemple :
trouble, production de gaz, virage de la coloration du milieu ).
La numération cellulaire est la détermination du nombre de cellules
contenues dans un volume précis de milieu liquide.
Un milieu liquide stérile (dans un tube) est ensemencé par 1ml
d’inoculum (produit pur ou dilution).
Après incubation, si le caractère recherché est apparu (trouble,
virage, gaz) le résultat est positif. Dans le cas contraire, il est rendu
négatif.

Résultat positif: il y a au moins 1 micro-organisme recherché dans


le volume initial d’inoculum (produit pur ou dilution).
Résultat négatif: il y a moins de 1 micro-organisme recherché dans
le volume initial d’inoculum (produit pur ou dilution).

2. Interprétation dans le cas d’un tube par dilution


a. Résultats positifs et négatifs observés
Volume inoculum Produit 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
1ml pur
résultats + + + + - - -

• Au moins 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 10-3


Au moins 103 micro-organismes dans 1 mL de produit pur

• Moins de 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 10-4


Moins de 104 micro-organismes dans 1 mL de produit pur.

Conclusion :
Concentration en micro-organismes dans le produit pur
comprise entre 103 et 104 microorganismes par mL.
103 ≤ [N] < 104 micro-organismes par mL.

b. Que des résultats positifs observés


Volume inoculum Produit 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
1ml pur: 100

résultats + + + + + + +

Au moins 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 10-6


Au moins 106 micro-organismes dans 1 mL de produit pur.
Concentration en micro-organismes dans le produit pur
supérieure ou égale à 106 microorganisme par mL.
[N] ≥ 106 microorganisme par mL

c. Que des résultats négatifs observés


Volume inoculum Produit 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
1ml pur: 100
résultats - - - - - - -

Moins de 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 100 donc


dans 1 mL de produit pur.
Concentration en micro-organismes dans le produit pur
strictement inférieure à 1 microorganisme par mL.
[N] < 1 micro-organismes par mL.
L’utilisation de cette méthode avec un tube par dilution entraîne
une forte incertitude des essais multiples (2 ou 3 tubes par
dilution).

3. Interprétation statistique: méthode du NPP (table de Mac


Grady)
Chaque essai doit être doublée ou triplée : ensemencement de 2
ou 3 tubes pour chaque dilution.
a. Principe

Jusqu’à présent, on utilisait une méthode générale pour


interpréter le dénombrement de bactéries en milieu
liquide (dans un aliment ou tout autre produit). Ainsi :

• Si le tube est + = il y a au moins une


bactérie / mL de la dilution considérée

• Si le tube est - = il y a moins de une


bactérie / mL de la dilution considérée
La méthode du NPP (Nombre le Plus Probable) ou MPN
(Most Probable Number) utilise une méthode
statistique pour connaître le nombre (le plus probable)
de bactéries présentes dans 1 mL de dilution.
 

Cette technique utilise plusieurs tubes par dilution (2,


3, 4 ou 5) et on compare les résultats à une table
statistique = la table de Mac Grady qui donne le NPP
sur la dilution considérée.

 Il s’agit donc d’une interprétation probabiliste


b. Technique
 Réaliser une gamme de dilution du produit
analyser

 Ensemencer 1 mL de chaque dilution dans


plusieurs tubes (2, 3, 4 ou 5) d’un milieu liquide
correctement choisi (qui favorise la croissance
de la grande majorité de germes)
 Incuber les tubes à la température adaptée
(environ 37°C)
c. Lecture
 Après incubation des tubes, noter dans un tableau pour
chaque tube si le résultat est positif (+) ou négatif (-).
Dilutions 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)

Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de
résultats +
Regroupement
 Grouper le nombre de résultats positifs par dilution
Dilutions 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)

Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de
3 3 2 1 0
résultats +
Regroupement
 Regrouper en nombre de 3 chiffres la suite de chiffres
obtenue en commençant par le chiffre obtenu par la plus
faible dilution.

Dilutions 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)

Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de
3 3 2 1 0
résultats +
Regroupement 332 321 210 - -
 Choix de la dilution pour le calcul, 2 méthodes sont
possibles :

• choisir la dilution qui possède le regroupement


le plus grand tout en étant inférieur à :
- 220 pour la méthode à 2 tubes / dilution
- 330 pour la méthode à 3 tubes / dilution
- 440 pour la méthode à 4 tubes / dilution
(etc…)
OU

• choisir la plus forte dilution contenant tous


des tubes positifs
Dilutions 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)

Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de
3 3 2 1 0
résultats +
Regroupement 332 321 210 - -
 Lire la valeur du NPP dans la table de Mac Grady et en
déduire la concentration des bactéries dans l’échantillon :
Nombre de tubes Nombre de tubes
positifs au niveau positifs au niveau
des 3 taux de NPP des 3 taux de NPP
dilution retenus dilution retenus
000 < 0,3 230 2,9
001 0,3 300 2,3
010 0,3 301 4
020 0,6 302 6
100 0,4 310 4
101 0,7 311 7
110 0,7 322 12
111 1,1 320 9
120 1,1 321 15
121 1,5 322 21
200 0,9 323 29
201 1,4 330 20
210 1,5 331 50
211 2,0 332 110
220 2,1 333 >110
221 2,8
- choix de la dilution : 10-1
- Détermination du NPP : regroupement choisi = 321 et
dans la table de Mac Grady le NPP correspondant à 321 est
15.
- Calcul :
NPP
N  Fd
Vensemencé

15
N   101  150  1,5.102 coliformes / mL
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ANALYSES MICROBIOLOGIQUES DES AMBIANCES ET SURFACES

I. INTRODUCTION
Les ambiances (air intérieur à un espace fermé) et les surfaces,
comme tous les milieux de l’environnement , présentent une
contamination microbiologique permanente mais variable dans le
temps et dans l’espace, donc renferment une flore
microbienne diversifiée, d’origines humaine et environnementale.

Les micro-organismes présents sont des saprophytes de


l’environnement mais aussi des commensaux ou des pathogènes
d’origine humaine. Certains de ces micro-organismes sont à l’origine
de l’altération de produits dans diverses industries et d’infections
associées aux soins chez les patients vulnérables dans les
établissements de santé.

Face à cette contamination omniprésente, la protection des produits


et des individus vulnérables ne peut être envisagée que dans un
environnement microbien maîtrisé. II s’avère ainsi nécessaire :
d’évaluer les risques de contamination et de gérer ces risques de
manière adaptée et cohérente.

de maîtriser en permanence et de surveiller régulièrement


la qualité microbiologique de l’ensemble des milieux de
l’environnement.

Cette surveillance repose sur diverses méthodes, anciennes ou plus


récentes, de prélèvement et d’analyse des micro-organismes de
l’environnement.

Les mesurages de la contamination microbiologique de ces milieux


participent à la sécurité des consommateurs.
II. BIOFILM : RÉSERVOIR MICROBIEN
Les bactéries (les microorganismes) ont le pouvoir d’adhérer et de se
multiplier sur divers supports inertes (surfaces ouvertes, surfaces
internes de canalisations d’eau ou de conduits d’air, matériels,
équipements, produits...) pour former, avec le recrutement
d’autres micro-organismes (autres espèces), un biofilm ou
écosystème cellulaire fixé.
Le biofilm des supports inertes est alimenté et entretenu en
permanence par les micro-organismes transmis par l’air, l’eau, les
personnes ou un autre support inerte .

La mise en place d’un biofilm sur un support inerte s’effectue


généralement selon trois étapes majeures :
- l’adhésion des cellules bactériennes au support qui débute par
l’attachement des cellules grâce à des forces physiques,
relativement labiles, puis la cellule bactérienne secrète des
substances polymériques qui lui permettent d’adhérer plus
fortement au support 
- la maturation du biofilm, qui correspond à la multiplication des
cellules, lorsque les conditions environnementales sont réunies
(température, humidité, apport de molécules organiques et
inorganiques) et à la formation d’une architecture multicouche
particulière (microcolonies, plaques, champignons) avec
production de la matrice d’exopolymères bactériens 

- le détachement cellulaire, sous forme de cellules individuelles,


d’amas ou d’agrégats microbiens, qui permet la colonisation de
nouveaux supports.

Les micro-organismes inclus dans un biofilm sont protégés par la


matrice organique de polymères extra-cellulaires bactériens. Ils
présentent des modifications physiologiques qui les rendent moins
sensibles que leurs homologues non fixés aux stress physiques ou
chimiques tels que l’action d’agents antimicrobiens (antibiotiques ou
désinfectants).
La fixation des micro-organismes sur un support inerte
favorise leurs capacités d’adaptation et de développement dans des
conditions environnementales défavorables.

III. CONTAMINATION DES SURFACES


La maîtrise de l’hygiène des surfaces nécessite de bien adapter la
conception de l’environnement, le choix des revêtements ainsi que
les méthodes et fréquences d’élimination des contaminants aux
activités exercées dans l’environnement considéré.

1. Mécanismes de la contamination des surfaces


Les surfaces constituent un support pouvant recevoir et héberger à la
fois des salissures et des micro-organismes.

Arrivés à proximité des surfaces réceptrices, par sédimentation ou


par contact, les micro-organismes peuvent adhérer par
l’intermédiaire d’interactions physico-chimiques qui dépendent des
des propriétés physico-chimiques de surface des micro-organismes et
du revêtement.
La rugosité et la topographie de la surface jouent également un rôle
important sur le nombre de bactéries adhérentes.

Dans des conditions favorables (température et hygrométrie des


locaux, nature et fréquence des opérations de décontamination...),
les cellules microbiennes ayant adhéré peuvent se multiplier sur la
surface et former un biofilm.

Les surfaces peuvent favoriser la persistance de flores microbiennes


indésirables, en particulier de flores résistantes à l’action d’agents
antimicrobiens. Elles peuvent également se comporter comme
émetteurs de micro-organismes.

Dans les zones à environnement maîtrisé, le concept de


 bionettoyage  combine un nettoyage des surfaces, une évacuation
des produits utilisés et des salissures à éliminer et l’application d’un
désinfectant.
2. Objectifs du mesurage des surfaces
L’évaluation de la contamination des surfaces est utilisée pour :
- vérifier l’application des procédures de nettoyage et de
désinfection ;
- déterminer le niveau microbiologique pour une activité donnée
(plan de surveillance régulière) ;
- renforcer la surveillance lors d’événements (exemple: la préparation
d’un produit biologique)

IV. CONTAMINATION DE L’EAU
La dégradation de la qualité microbiologique de l’eau peut survenir à
tout moment entre le lieu de production et le robinet de l’utilisateur.
Cette dégradation peut être liée à une prolifération de
microorganismes naturellement présents dans l’eau, voire à une
contamination dans les réservoirs, dans les canalisations publiques
ou dans les réseaux intérieurs de distribution des bâtiments.

L’étendue et la complexité des réseaux intérieurs, la formation d’un


biofilm à l’intérieur des canalisations, la présence de points de
stagnation de l’eau (espaces morts, robinets et brise-jets, pommeaux
de douche, adoucisseurs, ballons de stockage...), la réalisation de
travaux en l’absence d’une désinfection efficace prolifération des
micro-organismes présents dans l’eau.
La contamination des équipements périphériques par des micro-
organismes apportés par l’utilisateur participe également à la
contamination microbiologique de l’eau distribuée (rétro-
contamination).

Mécanismes de la contamination des circuits d’eau


Dans une canalisation d’eau, les matières organiques dissoutes dans
l’eau se déposent sur les parois et forment un film primaire
conditionnant composé de macromolécules nutritives.
Les caractéristiques de surface ainsi que la rugosité du matériau
peuvent influencer la formation de ce film conditionnant.

Les bactéries, apportées en permanence par le flux liquide, entrent en


contact avec la paroi grâce aux mouvements, turbulences, faible
circulation ou stagnation de l’eau.
L’adhésion bactérienne dépend de la nature du matériau, de l’espèce
bactérienne et des conditions environnementales.
Des forces physiques, de type Van der Waals ou électrostatiques,
assurent l’adhésion de la première couche bactérienne qui est
renforcée par la sécrétion par les bactéries de polymères
exocellulaires (protéines et polysaccharides), permettant ainsi de fixer
les cellules bactériennes à la paroi. L’apport continu par le flux liquide
d’oxygène et de substances nutritives CODB (carbone organique
dissous biodégradable par la flore bactérienne du réseau) entraîne la
croissance bactérienne.
Ce développement bactérien et l’adhésion d’autres microorganismes
augmentent de plus en plus la contamination de l’eau.

V. CONTAMINATION DE L’AIR
La contamination microbiologique de l’air a pour origine la formation
d’un bioaérosol (ensemble de fines particules en suspension dans
l’air) complexe qui peut contenir plusieurs contaminants
biologiques : micro-organismes vivants (bactéries, virus, levures,
moisissures), fragments microbiens antigéniques, toxines et/ou
autres substances d’origine microbienne.

La contamination de l’air dépend de trois conditions essentielles


(présence de sources de contamination, amplification microbienne
par multiplication active et dissémination par perturbation du
réservoir) qui conduisent à une contamination soit permanente, soit
le plus souvent transitoire de l’air ambiant, ou flore microbienne de
l’air.

1 Sources de contamination
Les réservoirs microbiens de l’air sont classiquement distingués en
réservoirs vivants, c’est-à-dire les personnes présentes dans le local,
et en réservoirs environnementaux.
Dans ces réservoirs de l’environnement, on retrouve les micro-
organismes saprophytes (bactéries et champignons microscopiques)
qui sont très résistants dans le milieu extérieur, et certains germes
pathogènes ou commensaux d’origine humaine qui survivent bien en
dehors de leur organisme-hôte.

2 Amplification microbienne
La multiplication active des micro-organismes, présents dans les
réservoirs, se produit lorsqu’il existe une infection chez un individu ou
lorsque sont réunies, dans un réservoir environnemental, toutes les
conditions nutritives, physico-chimiques et (micro)biologiques
nécessaires à la croissance de ces micro-organismes.

3. Flore microbien de l’air


L’air est un milieu difficile à étudier, et en plus les germes aériens sont
associés à des supports de caractères propres dont il faut savoir tenir
compte.
En 1883, MIGUEL met en évidence l’influence des saisons, de
l’hygrométrie, de la température, de la pression atmosphérique, de
l’électricité statique et de la radio-activité sur les variations
quantitatives des micro-organismes aériens.
En 1955, MAISSONET procède à l’analyse qualitative de la flore
microbienne de l’air et découvre la faible teneur en germes contenus
dans l’atmosphère et démontre l’uniformité des espèces, quelles que
soient les lieux ou les saisons de prélèvements, quelles que soient les
latitudes ou les longitudes.

Depuis cette description (1962), on oppose:


- une Flore microbienne Saprophyte de Base: présente en tous lieux,
qualitativement constante et composée de diverses espèces
microbiennes.
- une Flore Accidentelle, de transit, à laquelle appartiennent les
germes pathogènes.

Pour MAISSONNET, il existe un équilibre entre Flore de Base et Flore


de Transit, réalisant un écosystème bactérien de l’atmosphère,
véritable zone de protection à l’égard du développement des germes
pathogènes.
4- Le transport aérien des micro-organismes (dissémination
aérienne)
Les germes ne vivent que très rarement à l’état libre et leur transport
aérien requiert le concourt d’un support de nature variable:
- des poussières, de grandes tailles, visibles à l’oeil nu, assimilées à
des réservoirs de nature animale ou végétale, elles offrent tous les
éléments propices à la survie des bactéries ; elles sédimentent
rapidement.
- des gouttelettes de Flugge (1888), chargées d’inoculum bactérien,
dont la taille est fonction de l’activité respiratoire de l’homme. En
atmosphère humide, leur sédimentation rapide, minimise leur
inocuité.
- des Doplets Nucléi, gouttelettes de petites tailles qui, en se
desséchant, se réduisent à l’état de noyau de 2 à 3 microns. Animés
de mouvements Browniens, ils demeurent indéfiniment en
suspension dans l’air (exemple: les virus de la grippe).

Pour la plupart des germes, leur support est aéroporté. Certains


microorganismes nécessitent un vecteur actif (moustique, mouche,
acarien) et d’autres, un vecteur obligatoire (exemples: Anophèle pour
le Paludisme, Aedes pour la Fièvre Jaune).

Les micro-organismes et leurs supports + la qualité de


l’environnement = un Ensemble Particulaire Aérien Indissociable,
réalisant l’Aéro-bio-contamination.

L’ air extérieur contient 1 à 5 milliards de particules


microbiennes/mètre cube.

5 - Les sources de la contamination


La teneur en germes est faible lorsque la densité de la population est
faible, mais elle augmente considérablement dès que l’on pénètre
dans les agglomérations polluées par l’industrialisation.

La pollution micro-organique trouve principalement sa source dans


l’activité humaine.
L’Homme porte un grand nombre de germes, qu’il transporte d’un
endroit à l’autre par ses mouvements et par tout ce qu’il touche. La
peau, les cheveux, la respiration constituent des sources
inépuisables. Les tissus de nos vêtements abritent de nombreuses
particules et les tissus synthétiques les attirent par leur propriétés
électrostatiques.

Selon son activité, une personne émet par minute, une quantité
impressionnante de particules, d’un diamètre moyen de 0,5 micron.
A savoir :
- 100 000 particules microbiennes : assis, sans activités ;
- 1 000 000 p. : assis ou debout, avec mouvements des bras, des
jambes, de la tête et du corps ;
- 5 000 000 p. : pendant une marche normale ;
- 10 000 000 p. : pendant une marche accélérée.

Ce renouvellement permanent des germes au détriment de notre


organisme nous permettent de distinguer :
- des micro-organismes résidents, formant une population stable,
qu’il n’est pas possible d’éliminer.
- des micro-organismes transportés, contaminants, répandus dans
l’environnement, qu’il y a lieu d’éradiquer.

La biocontamination est nettement plus importante en AIR CONFINE


qu’en AIR LIBRE.

Parler de micro-organismes de l’air, mérite que l’on s’intéresse à leurs


lieux de prolifération à haute densité : les salles et les lieux à hauts
risques de contagiosité.

6 - L’évaluation en vue de la décontamination dans les zones à haute


protection
applications de la DECONTAMINATION :
- Des surfaces et des objets, dépositaires des microorganismes ;
- Du matériel et des machines, brassant une multitude de particules
- De l’eau, élixir de vie pour toute une série de germes ;
- Des produits d’origines animales ou végétales ;
- Des substances minérales et organiques, à haut pouvoir
En fonction des risques encourus évaluation qualitative et
quantitative de la contamination potentielle.

L’ évaluation quantitative:
comptage électronique des particules qui apprécient le degré de la
pollution.
Le compteur détecte les particules de 0,3 à 20 microns à la lumière
blanche et de 0,12 à 10 microns au rayonnement laser.
Un contrôle régulier évaluation du degré de la contamination
du local et celui engendré par le personnel et les machines en
mouvement.

L’évaluation qualitative:
analyse d’un certain volume d’air en vue d’un comptage et d’une
identification biologique après mise en culture.
Le recueil des bactéries s’obtient par sédimentation sur boites de
Pétri, méthode simple et peu coûteuse ; ou par l’emploi de capteur
et collecteur d’air, technique mieux adaptée à la surveillance
rigoureuse de la décontamination d’un local.
Il existe actuellement un grand nombre d’activités pour lesquelles, un
environnement ‘HORS GERMES” est souhaitable, du fait des
risques que les microorganismes peuvent engendrer.

Exprimé en fonction du nombre de particules/unité de volume et de


bactéries/cm3, les normes françaises définissent trois classes
d’empoussièrement selon les critères suivants :
- Salle à empoussièrement contrôlé ; les risques de
biocontamination peuvent être considérés comme minimes :
habitat, établissements scolaires, ou administratifs.
- Salle propre ; les risques de contamination méritent considération,
milieu hospitalier, institution médicalisée.
- Salle ultrapropre ; les risques de l’aéro-bio-contamination sont
sévères comme dans les blocs opératoires ou les salles de
production industrielles de molécules diverses.

7 - La maîtrise de l’assainissement de l’air


Vouloir réduire l’aéro-bio-contamination dans une zone protégée à
haut risque mise en place d’un ensemble de mesures
agissant au niveau des circuits de ventilation et des personnes.
Les circuits de ventilation éliminent de façon continue la
contamination produite ; la réalisation repose sur quelques principes
élémentaires :
- Empêcher la contamination par des systèmes de filtration efficace.
La filtration de l’air se fait en cascade : préfiltre pour les plus
grosses poussières ; filtre à haute efficacité où l’on retrouve des
particules de 3 à 10 microns, correspondant pratiquement à la
taille de la plupart des germes ; filtres absolus de type HEPA,
retenant les micro-organismes et microparticules de 0,3 micron.
- Eliminer en permanence les particules régénérées par les
mouvements du personnel et des machines en assurant une
ventilation continue, à raison d’un changement d’air de 20 à 40
volumes horaire. Le brassage contrôlé est obtenu soit par un
système à dilution de l’air contaminé, soit par un système à flux
contrôlé, de type laminaire, qui conditionne un courant parallèle
de l’air et des particules jusqu’à leur filtration.
Le travail en zone stérile nécessite une formation du personnel qui est
d’une importance primordiale : l’opérateur est la principale source de
contamination, la plus difficile à maîtriser.

VI. MAÎTRISE DE L’ENVIRONNEMENT MICROBIEN


La maîtrise de la contamination microbiologique d’un environnement
donné demande d’établir, de mettre en œuvre et d’entretenir un
système formalisé afin d’évaluer et maîtriser en permanence
l’ensemble des facteurs susceptibles d’avoir une incidence sur la
qualité microbiologique de cet environnement.

Cette maitrise s’appuie sur la norme NF EN ISO 14698-1 qui décrit les


principes généraux et les méthodes de la maîtrise de la
biocontamination dans les salles propres et environnements
maîtrisés apparentés.

1 Évaluation des risques microbiologiques


Il convient d’identifier le ou les dangers microbiologiques potentiels
associés à un procédé, un produit ou un patient, c’est-à-dire toutes les
sources potentielles de contamination (air, eaux, surfaces,
personnes...) qui peuvent être à l’origine d’éléments biologiques
responsables d’un effet indésirable.

L’équipe chargée de l’analyse des risques doit évaluer la probabilité


que le ou les dangers identifiés se produisent, en prenant en compte
l’ensemble des facteurs de risques associés au procédé, au produit ou
au patient à protéger.

Selon le niveau de risque attribué des zones à risques très


élevés, risques élevés, risques moyens ou risques faibles ou
négligeables.

Une zone à risques est un espace défini et délimité, où des individus,


des produits ou des procédés (ou une combinaison quelconque de cet
ensemble) présentent une vulnérabilité particulière à la
contamination.
2. Maitrise permanente des risques microbiologiques
Dans chacune des zones à risques définies:
- identifier les mesures préventives, adaptées et cohérentes entre
elles, pour maîtriser les risques microbiologiques (=le système de
maîtrise de la contamination microbiologique).
- déterminer les points critiques de maîtrise, c’est-à-dire les points,
les procédures, les étapes de l’opération ou les conditions de
l’environnement que l’on peut maîtriser afin d’éliminer le ou les
dangers microbiologiques ou de réduire la probabilité qu’ils se
produisent.

VII. CONCLUSION
Les méthodes de prélèvement et d’analyse microbienne dans les
milieux de l’environnement (air, surfaces, eau) ont fait l’objet de
nombreux travaux afin d’améliorer la collecte, la quantification et
l’identification des microorganismes.

Les efforts ont été plus marqués pour les prélèvements d’air avec le
développement de nouveaux capteurs et biocollecteurs une
meilleure évaluation de l’exposition humaine ou de produits
industriels.

À côté des méthodes d’analyse culturales ou conventionnelles, qui


restent toujours recommandées, de nouvelles méthodes, dites
alternatives, de quantification et d’identification des micro-
organismes sont disponibles résultats plus rapide et une
meilleure connaissance de la flore microbienne de l’environnement
étudié. une mesure directe des micro-organismes
(bioluminescence, épifluorescence, cytométrie de flux) ou la
détection de composants cellulaires (spectrométrie de masse, analyse
du génome).

Les évolutions technologiques des méthodes microbiologiques, dans


les domaines du prélèvement et/ou de l’analyse, font ainsi une place
de choix à la surveillance microbiologique, réglementaire ou non, d’un
environnement industriel ou de soins, par les différents atouts qu’elle
apporte au gestionnaire de cet environnement (points critiques mieux
étudiés, actions correctives plus rapides...,).
CHALLENGE TEST

La règlementation européenne précise que toute substance mise


sur le marché doit être sûre et saine. Pour cela, différents moyens
sont disponibles dont les challenge-tests.

Un challenge test est une technique permettant de démontrer


l'efficacité anti-microbienne (bactériostatiqueou bactéricide) d'une
substance donnée (produits pharmaceutiques, cosmétiques ou
agroalimentaires par exemple).

Cette technique consiste à inoculer une quantité connue de


différents germes microbiens (bactéries, levures, moisissures...)
dans la substance à tester, puis de dénombrer ces germes à diverses
échéances (suivi de l’évolution du nombre de germes en fonction du
temps = cinétique du nombre de germes dans la substance).

Un  challenge-test ou test de croissance microbiologique ou


test d’efficacité de la conservation antimicrobienne ou test
d’épreuve microbiologique :
• est établi par la pharmacopée européenne ou pharmacopée US
pour les médicaments et les produits cosmétiques
NORME ISO 11930 : 2012
Principe de la methode
• Ce test consiste en la contamination artificielle du produit
cosmétique avec différents micro-organismes (généralement
identifié comme un danger) en nombre connu et au suivi de
l’évolution de ce nombre en fonction du temps.
• La population microbienne pour chaque souche est évaluée après
2, 7, 14, 21 et 28 jours ( surtout après 7, 14 et 28 jours).  

L’avantage du challenge-test est de pouvoir tirer des conclusions sur


des faits établis car le produit a été inoculé volontairement de
manière contrôlée avec des microorganismes préalablement
sélectionnés, contrairement à une contamination naturelle.

Ces dernières années, la grande majorité des challenge-tests


effectués sur les produits pharmaceutiques était réalisée : soit avec
un pathogène de référence (exple: Listeria monocytogenes), soit avec
des flores d’altération type levures et moisissures ou bactéries
lactiques.

Depuis deux ans, la tendance est l’utilisation de challenges tests pour


définir une durée de vie du produit après ouverture car cette
information est mentionnée par les industriels sur l’étiquetage.
Le challenge test est prioritairement dédié au développement des
produits nouveaux. Il peut aussi être mis en œuvre lorsque l’on vise
de nouveaux objectifs, par exemple une durée de vie prolongée.

Le challenge test est:


- un outil scientifique au service des fabricants qui souhaitent mieux
appréhender certaines des caractéristiques de leurs produits ou de
leurs procédés, faire évoluer leurs recettes ou leurs technologies,
tester l’aptitude à la conservation de produits nouveaux..

- l’étude des risques microbiologiques par rapport à un produit et


s’inscrit donc dans une logique d’évaluation des risques.

Remarques:
- Le problème majeur actuel se situe au niveau de la fiabilité des
résultats. En effet, beaucoup de paramètres peuvent les influencer
(état physiologique des souches, protocole de réalisation du test,
niveau d’ensemencement,...).
- la mise en œuvre du challenge test suppose par ailleurs d’être faite
avec un minimum de déontologie et d’harmonisation. C’est
pourquoi, il s’agit avant tout d’un outil scientifique d’étude au
service des fabricants de produits et non un outil de contrôle.
LES ETAPES DE LA REALISATION DES CHALLENGE TESTS
(Notermans et al., 1993)

1. description du test :
- Approche de l’expérience
- Reproductibilité/répétabilité
- Sécurité
2. inoculation:
- Choix de l’inoculum
- Méthode de conservation des souches
- Préparation de l’inoculum
- Taille de l’inoculum
- Méthode d’inoculation
3. réalisation du test:
- Temps et température d’incubation
- Taille du prélèvement et fréquence
- Procédure
4. interprétation des résultats
ANALYSES MICROBIOLOGIQUES DES COSMETIQUES, PHYTOMEDICAMENTS ET AROMES
I GENERALITES

A)CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.

1 MICROORGANISMES RECHERCHÉS. 
• La présence de micro-organismes peut
 Réduire l’efficacité des principes actifs
 Induire des problèmes de santé

• produits à faible risque de contamination  :


– Dénombrement de germe indicateur de la qualité globale :
– les germes totaux (DGAT ou FAMT : dénombrement des germes aérobies totaux)
– les levures et moisissures (DMLT : dénombrement des moisissures et levures totales)
– Recherche des microorganismes spécifiques,pour quelques produits particuliers :
E.coli , Salmonella , Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus.

• Leur recherche va dépendre :


– De la voie et le mode d’administration
– De la nature du produit et son aptitude à favoriser la croissance microbienne
– De la catégorie de patients visée (YOPI)
– De l’état du patient : Existence de blessures, lésions organiques, utilisation d’immunosuppresseurs.
2 TECHNIQUES 
• Préparation de l’échantillon avec
– un diluant avec neutralisant tamponné pour arrêter l’action des
antimicrobiens présents (PA ou conservateur)
– un tensio-actif pour mélanger les produits de nature lipidique 
• Méthode de dénombrement
• Filtration
• Dénombrement en milieu solide (produit non filtrable)
• Les milieux de culture recommandés par la
pharmacopée sont :
– Milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja (PTA) pour la
FMAT
– Milieu Sabouraud glucosé gélosé + ATB  pour les levures
moisissures

2.6.12. Contrôle microbiologique des produits non stériles :essais de dénombrement microbien ....................
2.6.13. Contrôle microbiologique des produits non stériles :recherche de microorganismes spécifies..............
ANCIENS CRITÈRES. 
La limite prescrite dans la contamination microbienne dans des produits non
obligatoirement stériles est
102 micro-organismes par ml ou par gramme.
Limite maximale d'acceptation 5.102 micro-organismes par mL ou par gramme.
• Si absence totale de développement, rendre < à 1 micro-organisme par ml ou par
gramme.
• Si développement, choisir le résultat le plus défavorable.
– Si le résultat est > 102 micro-organismes par ml ou par gramme, réaliser une coloration
de Gram.
• si bacilles Gram +, faire une recherche de spores et pas d'identification.
• si bacilles Gram-, faire une identification.
• si coques Gram +, faire une identification.
La conformité ou la non conformité du produit dépend du micro-organisme identifié et du traitement appliqué
au produit.
– Si le résultat est > 5.102 micro-organismes par ml ou par gramme, effectuer un deuxième
essai sur le même échantillon et éventuellement un troisième essai sur un échantillon
différent du même lot.
• Si le deuxième essai est bon, rendre comme résultat: produit conforme; de même pour le troisième essai.
• Si un des deux essais terminaux est non conforme, le produit est rejeté.
5.1.4. Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques et des
3 CRITÈRES D’ACCEPTATION. (PH Eu 8.0 2014)
substances pour usage pharmaceutique non stériles (5.8.)

Les critères d’acceptation de la qualité microbiologique sont interprétés ainsi :


– 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20
– 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 etc….

DGAT DMLT Micro-organismes spécifiés


Voie d’administration UFC/g ou /mL UFC/g ou /mL Absence dans ( )

Orale : préparation non aqueuse 103 102 Escherichia coli (1g ou 1 mL)

Orale : préparation aqueuse 102 101 Escherichia coli (1g ou 1 mL)

Rectale 103 102

Buccale, Gingivale 102 101 Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)


Cutanée, Nasale, Auriculaire Pseudomonas aeruginosa(1g ou 1 mL)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)


Vaginale 102 101 Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)
Candida albicans (1g ou 1 mL)

Transdermique 102 101 Staphylococcus aureus(1 dispositif)


Pseudomonas aeruginosa (1 dispositif)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)


Inhalation 102 101 Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)
Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires (1g ou 1 mL)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)


Préparation à base de MP naturelle ne pouvant 10 4
102 Escherichia coli (1g ou 1 mL)
subir de prétraitement antimicrobien Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 102 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL

Aliments médicamenteux vétérinaire ne Escherichia coli (1g ou 1 mL)


pouvant subir de prétraitement antimicrobien 105 104 Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 104 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES
Médicament à analyser
1 RECHERCHE DE MICRO-ORGANISMES
– Etant des produits stériles, il ne s’agit plus de dénombrer mais de
vérifier
– l’absence de tout microorganisme (FMAT, levures Bouillonmoisissures,
Schaedler
bactéries anaérobies en bouillon thyoglycolate)
– L’absence de particules
– mais aussi d’endotoxine.

– Vue l’absence de microorganisme dans le produit, il faut tester de grand


volume d’échantillon d’où l’utilisation des techniques de filtration.

– Afin de limiter encore le risque de contamination par l’environnement,


l’appareil de filtration est manipulé sous des isolateurs : PSM de type III
ou équipés d’un hémi scaphandre.  
2) RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE. 
 Les normes de la pharmacopée imposent l'absence de substances
pyrogènes (susceptible de provoquer une augmentation de la température)
dans les produits pharmaceutiques qui entrent en contact avec la
circulation sanguine ou le système nerveux central.
Les pyrogènes sont soit
- des micro-organismes responsables d’infections
- des substances sécrétées par des micro-organismes persistant
après la destruction de celui-ci ex : endotoxine
• L'essai permettant la détection des endotoxines
bactériennes est un essai in vitro réalisé à l'aide
d'un réactif, le lysat d'amoebocytes de Limule
(LAL), obtenu à partir des cellules circulantes de
cet animal : le limule.
 

http://www.eprofeel.tv/v
/102,charles-river-le-dos
age-des-endotoxines.htm
l
C) CONTRÔLES QUALITÉ.
• Afin de valider les contrôles sur les lots de fabrication, il est nécessaire de
vérifier la conformité :
- des milieux
- des diluants
- des produits à examiner. 
• Les tests réalisés sont :
- des tests de stérilité des milieux et diluants:
ils permettent de contrôler leur non contamination lors de leur préparation et de leur
conservation en les plaçant (milieu prêt à l’emploi donc conditionné en boite et non ensemencé) à
l’étuve pendant le temps et à la température d’incubation utilisés habituellement.(voir TP)
- des tests de fertilité des milieux :
- ils permettent de déterminer si le milieu a conservé les qualités nutritionnelles attendues au cours
de sa préparation ou de sa conservation.
- On ensemence le milieu avec une suspension bactérienne de référence (ATCC) de concentration
connue de façon à retrouver environ 100 colonies sur le milieu.(voir TP)
- L’absence de culture ou un résultat < 30 colonies traduit un problème de fertilité. 
- des tests permettant de vérifier l’absence d’antimicrobien dans le produit
examiné.
- Il consiste à mettre en contact le produit avec les souches de référence et de comparer les résultats
obtenus avec un témoin réalisé sans produit.(voir TP)
Interprétation des résultats
 
Dossier de lot ANALYSES

Produit finis, vrac, MP, article de


Résultats conditionnement
conformes hors spécification

Enquête
Retraitement

Libération de Destruction
lot du lot
II) COSMETIQUES
1- Législation
Les produits cosmétiques devraient être sûrs dans des conditions
d’utilisation normales ou raisonnablement prévisibles:
Obligation de respecter les Bonne Pratique de Fabrication (PBF) :
norme NF EN ISO 22 716

• Un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant des


micro-organismes pathogènes peut avoir des conséquences
graves sur l’écologie cutanée de l’utilisateur, surtout sur une
peau lésée ou chez des individus peu résistants. 

• De nombreux produits cosmétiques ont une composition et une


teneur en eau permettant la multiplication microbienne. Ils
contiennent des conservateurs afin de limiter cette prolifération.
<
• Différents contrôles et recherches microbiologiques sont
réalisés sur les produits cosmétiques afin d’évaluer leur
niveau d’hygiène et de prévoir leur comportement vis-à-vis
d’éventuelles contaminations.

2- Risques microbiologiques
Appréciation du risque microbiologique (norme ISO
29621:2010)

Les produits finis évalués à faible risque par cette norme ne


nécessiteront pas la mise en œuvre des normes microbiologiques
relatives aux cosmétiques
Exemples de produits à faible risque

Facteur physicochimique Limite Exemple

pH ≤ 3,0 Soins peeling (acide


glycolique)
pH ≥ 10,0 Produits défrisants

Éthanol ou autre alcool ≥ 20 % Laques, toniques, parfums

Température de remplissage ≥ 65,0 °C Pommades pour les lèvres,


rouges à lèvres, fards à joues
Activité de l'eau, aw ≤ 0,75a Pommades pour les lèvres,
rouges à lèvres, fards à joues
Produits à base de solvants Vernis à ongles

Oxydants Colorants capillaires

Chlorhydrate d'aluminium ≥ 25 % Anti-transpirants


• L'analyse de risque microbiologique dépend de plusieurs
paramètres tels que :
- l'altération potentielle des produits cosmétiques;
- le caractère pathogène des micro-organismes;
- le site d'application du produit cosmétique (cheveux, peau, yeux,
muqueuses, etc.);
- la catégorie d'utilisateurs (adultes, enfants de moins de 3 ans, etc.).
• recherche d'agents pathogènes pour la peau
Les bactéries:
- Staphylococcus aureus,
 - Pseudomonas aeruginosa 
 - Candida albicans 
• recherche des indicateurs de contamination fécale (les coliformes)
pour détecter une défaillance de l'hygiène au cours du processus de
fabrication.
- Escherichia coli (Un germe « témoin » ou indicateur de
contamination fécale (l’exemple type de coliforme). C’ est un
germe commensale de l'intestin de l'Homme ou des animaux, et
dont la présence traduit une contamination fécale.)
3- Analyses microbiologiques
Plusieurs étapes indispensables pour assurer l’innocuité du
produit (aucun danger pour la santé):
a) Au cours de la recherche et du développement (R&D) en
laboratoire:
• Formulation du produit fabrication en pilote
- sensibilité microbiologique (ISO 9621:2010)
trois catégories de produits:
* les produits à faible risque microbiologique pour lesquels il n’est
pas nécessaire de soumettre le produit fini à un challenge test pour la
conservation, ni à des contrôles microbiologiques. Une justification
scientifique est toutefois requise;
* les produits à usage unique et les produits qui ne peuvent être
ouverts (par exemple, dont le conditionnement permet de doser le
produit sans que celui-ci n’entre en contact avec l’air), pour lesquels
seuls des contrôles microbiologiques sur le produit fini sont
nécessaires. Une justification scientifique est toutefois requise;
* tous les autres produits, pour lesquels un challenge test
pour la conservation et des contrôles microbiologiques sur le produit
fini sont nécessaires.
- chalenge test
- validation des neutralisants (diluant, milieu) pour le
dénombrement
• Recherche principe actif conservateur
- effet inhibiteur des conservateurs

b) Fabrication à l’échelle industrielle:


- contrôle d’atmosphère (ambiance)
- contrôle des surfaces
- contrôle de l’hygiène du personnel
- contrôle microbiologique du produit en vrac

c) conditionnement:
- dénombrement et détection de la flore mésophile
aérobie (FMA ou FAMT = flore aérobie mésophile totale)
- dénombrement des levures /moisissures
- détection des pathogènes
- détection des micro-organismes spécifiés et non
spécifiés
4- Contrôle des produits finis
a) Préparation de la suspension mère :
le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation et le moment où
l’inoculum entre en contact avec le milieu de culture ne doit pas
dépasser 45 min
La suspension mère est préparée à partir d’un échantillon d’au moins
1 g ou 1 ml du produit d’essai mélangé avec soin.
préparation d’une dilution 10-1
- Produit miscible à l’eau
9 mL de diluant-neutralisant + S (g ou ml) de produit
- Produit non miscible à l’eau
9 mL de diluant neutralisant + polysorbate 80 + S (g ou ml) de
produit
S = quantité
b) Neutralisation des propriétés antimicrobiennes d’un produit
Composés chimiques pouvant neutraliser
Conservateur l'activité antimicrobienne des conservateurs

Produits phénoliques: Lécithine

Polysorbate 80
parabens, phénoxyéthanol, phényléthanol,
Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras
etc.

Tensioactifs non ioniques


Anilides

Lécithine, saponine, polysorbate 80,


Ammoniums quaternaires
dodécylsulfate de sodium

Tensioactifs cationiques Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras

Aldéhydes
Glycine, histidine
Agents générateurs de formaldéhyde

Oxydants Thiosulfate de sodium


La neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit doit
être vérifiée et validée
La validation est réalisée en contaminant le produit avec des
souches de référence et en effectuant le dénombrement contre un
témoin sans produit.
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa ou E.coli
Candida albicans

c) Dénombrement et détection
En plus du dénombrement , une détection est également réalisée
dans un bouillon « d’enrichissement » incubé pendant 20H.
Bouillon Eugon LT 100
  Bouillon pour enrichissement

Peptone pancréatique de caséine 15 g


Peptone papaïque de soja 5,0 g
L-cystéine 0,7 g
Chlorure de sodium 4,0 g
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d’oeuf 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Octoxynol 9 1,0 g
DÉTECTION des GERMES PATHOGÈNES
Souche et norme Ps. aeruginosa St aureus E.Coli C.Albicans
(ISO 21 150) (ISO 21 718) (ISO 21 148) (ISO 18 416)
Milieu Cétrimide Baird parker Mac Conkey SDA

Colonies Pigment jaune-vert Colonies noires et Colonie rouge Colonies convexes


caractéristiques (pyocyanine), brillantes, brique; peut être et crémeuses, de
fluorescent sous entourées d'un entourée d'une couleur blanche à
rayonnement UV halo clair (de 2 mm zone de bile beige
à 5 mm) précipitée.
Méthode Gram Gram Gram Gram
d’identification* Test enzymatique Test enzymatique Test enzymatique Test de
Isolement sur Test coagulase Isolement sur EMB filamentation
« Pseudomonas P » (24 à 48 H à 32,5°C) Test de
(24 à 48 H à 32,5°C) chlamydosporulatio
n

Résultat Bacille Gram – Coque Gram+ Bacille Gram – Cellules ovoïdes


Oxydase + Catalase + Oxydase – violettes
Colonies entourées Coagulase + Colonies bleu noir à Filaments
d’une zone bleu- reflet métallique Chlamydospore
verte (pyocyanine) sur EMB Blastospore
ou rouge marron
(pyorubine)

* Minimale : galerie biochimique ou autre méthode validée


possible
III) PHYTOMEDICAMENTS
Contrôles microbiologiques
Les médicaments à base de plantes destinés à une administration par
voie orale doivent répondre aux spécifications définies dans la
monographie (étude complète et détaillée sur un sujet précis)
«QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DES MÉDICAMENTS À BASE DE
PLANTES POUR USAGE ORAL » de la Pharmacopée Européenne.

Ceux qui sont destinés à d’autres voies d’administration que la voie


orale doivent être conformes à la monographie « QUALITÉ
MICROBIOLOGIQUE DES PRÉPARATIONS PHARMACEUTIQUES ET DES
SUBSTANCES POUR USAGE PHARMACEUTIQUE NON STÉRILES » de la
Pharmacopée Européenne.

Quant aux médicaments à base de plantes présentés sous des formes


galéniques devant être stériles (collyres et injectables), ils doivent
satisfaire à l’essai de stérilité, c’est-à-dire ne renfermer aucun micro-
organisme.
La monographie « QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DES PRÉPARATIONS
PHARMACEUTIQUES ET DES SUBSTANCES POUR USAGE
PHARMACEUTIQUE NON STÉRILES » définit les critères
d’acceptation de la qualité microbiologique des formes
pharmaceutiques non stériles, en fonction de leur voie
d’administration. Les spécifications retenues sont indiquées dans le
tableau ci-après.

Légende du tableau
- DGAT = dénombrement des germes aérobies viables totaux
- DMLT = dénombrement des moisissures et levures totales
- UFC = unités formant des colonies
Voie d’administration DGAT (UFC / DMLT (UFC / g ou Micro-organismes spécifiés
g ou UFC / UFC / mL)
mL)
Voie orale : préparations non 103 102 Absence d’Escherichia coli (dans 1 g ou 1 mL)
aqueuses
Voie orale : préparations 102 101 Absence d’Escherichia coli (dans 1 g ou 1 mL)
aqueuses
Voie rectale 103 102 -

Voie buccale - Voie gingivale 102 101 Absence de Staphylococcus aureus et


Voie cutanée - Voie nasale Pseudomonas aeruginosa (ds 1 g ou 1 mL)
Voie auriculaire
Voie vaginale 102 101 Absence de: Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus et Candida albicans
(dans 1 g ou 1 mL)
Voie transdermique (limites 102 101 Absence de: Staphylococcus aureus et de
pour un dispositif Pseudomonas aeruginosa (dans 1 dispositif)
transdermique)
Inhalation (préparations liquides 102 101 Absence de: Staphylococcus aureus,
dispensées au moyen de Pseudomonas aeruginosa et de bactéries Gram-
nébuliseurs) résistantes aux sels biliaires (dans 1 g ou 1 mL)
Disposition spéciale pour 104 102 Au maximum 102UFC de bactéries Gram-
administration par voie orale résistantes aux sels biliaires (dans 1 g ou 1 mL)
lorsqu’un prétraitement
antimicrobien est impossible et Absence de: salmonelles, d’Escherichia coli et
que l’Autorité compétente de Staphylococcus aureus (dans 1 g ou 1 mL)
admet une DGAT des matières
premières supérieure à 103
UFC / g ou UFC / mL.
La monographie « QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DES MÉDICAMENTS À
BASE DE PLANTES POUR USAGE ORAL » distingue trois catégories de
médicaments à base de plantes, en fonction de leur forme galénique
ou de leur mode de préparation et définit les contrôles
microbiologiques qui doivent être pratiqués :
- dénombrement des germes aérobies viables totaux (DGAT ou
FAMT)
- dénombrement des moisissures et levures totales (DMLT)
- recherche de germes spécifiés (bactéries Gram négatives
résistantes aux sels biliaires, Escherichia coli et salmonelles).

Les critères d’acceptation correspondant respectivement aux


catégories A, B et C sont indiqués ci-après.

« A. Médicaments à base de plantes contenant des drogues végétales,


avec ou sans excipients, qui sont destinés à la préparation d’infusions
ou décoctions avec de l’eau bouillante (exemple : tisanes avec ou sans
aromatisants)
DGAT Critère d’acceptation : 107 UFC / g
Nombre maximum admissible : 5.107 UFC / g
DMLT Critère d’acceptation : 105 UFC / g
Nombre maximum admissible : 5.105 UFC/g
Escherichia coli Critère d’acceptation : 103 UFC / g
Salmonelles Absence (25 g)

B. Médicaments à base de plantes contenant, par exemple, des


extraits et / ou des drogues végétales, avec ou sans excipients, dont le
procédé de production (par exemple par extraction) ou le cas échéant,
dans le cas des drogues végétales, de prétraitement permet de
réduire le nombre de micro-organismes présents jusqu’à un niveau
inférieur aux critères spécifiés pour la catégorie A.
DGAT Critère d’acceptation : 104 UFC / g ou UFC / mL
Nombre maximum admissible : 5.104 UFC / g ou UFC / mL
DMLT Critère d’acceptation : 102 UFC / g ou UFC / ml
Nombre maximum admissible : 5.102 UFC / g ou UFC / mL
Bactéries Gram- Critère d’acceptation : 102 UFC / g ou UFC / ml
résistantes aux sels biliaires
Escherichia coli Absence (1 g ou 1 mL)
Salmonelles (2.6.31) Absence (25 g ou 25 mL)
C. Médicaments à base de plantes contenant, par exemple, des
extraits et / ou des drogues végétales, avec ou sans excipients, dont il
peut être démontré que le procédé de production (par exemple par
extraction à l’éthanol de faible concentration ou à l’eau bouillante, ou
par concentration à basse température) ou, dans le cas des drogues
végétales, de prétraitement, ne permet pas de réduire suffisamment
le nombre de microorganismes présents pour satisfaire aux critères
spécifiés pour la catégorie B.
DGAT Critère d’acceptation : 105 UFC / g ou UFC / mL Nombre
maximum admissible : 5.105 UFC / g ou UFC / mL
DMLT Critère d’acceptation : 104 UFC / g ou UFC / ml Nombre
maximum admissible : 5.104 UFC / g ou UFC / mL
Bactéries Gram- Critère d’acceptation : 104 UFC / g ou UFC / ml
résistantes aux sels biliaires
Escherichia coli Absence (1 g ou 1 mL)
Salmonelles Absence (25 g ou 25 mL)

Il est admis que, pour certains médicaments à base de plantes, les


critères indiqués ci-dessus sous A, B, C pour le DGAT, le DMLT et les
bactéries Gram- résistantes aux sels biliaires sont impossibles à
satisfaire en raison du niveau usuel de contamination microbienne.
Des critères d’acceptation plus élevés peuvent alors être appliqués sur
la base d’une évaluation du risque prenant en compte
la caractérisation qualitative et quantitative de la biocharge et l’usage
auquel est destiné le médicament considéré.

S’il a été démontré qu’aucune des recherches prescrites ne permet un


dénombrement valide des micro-organismes spécifiés, une méthode
validée ayant une limite de détection aussi proche que possible du
critère d’acceptation indiqué est utilisée.

Force est de constater l’importance du mode de préparation du


médicament sur la détermination des critères d’évaluation de sa
qualité microbiologique : en effet, un procédé faisant intervenir la
chaleur comme l’infusion permet de réduire considérablement le
nombre de germes présents dans la préparation finale.
IV) AROMES
1- Législation
La Commission européenne introduit une procédure uniforme,
efficace, rapide et transparente pour l’autorisation des additifs, des
enzymes et des arômes alimentaires dans la Communauté. Cette
procédure est fondée sur une évaluation des risques par l’Autorité
européenne de sécurité des aliments (EFSA).
Règlement (CE) n° 1331/2008 du Parlement européen et du Conseil
du 16 décembre 2008 établissant une procédure d’autorisation
uniforme pour les additifs, enzymes et arômes alimentaires.

D’après le texte de ce règlement:


- Pour protéger la santé humaine, l’utilisation des additifs, des
enzymes et des arômes dans les denrées destinées à l’alimentation
humaine doit être soumise à une évaluation de leur innocuité avant
leur mise sur le marché de la Communauté.

Respect des critères microbiologiques lors de la production des


arômes (comme toute denrée alimentaire)
Voici, par exemple, un critère issu du Règlement CE 2073/2005:

matrice paramètre n c m M stade méthode


Une denrée Staphylococcus 5 2 10 100 Fin de IS0 6888
alimentaire aureus UFC/g UFC/g fabrication
D’après la norme la valeur de M = m x 10

Cela signifie qu’il faut analyser 5 échantillons par lot et que ces
échantillons doivent contenir moins de 10 Staphylococcus aureus/g,
avec toutefois une tolérance de 2 échantillons pouvant se trouver
entre 10 et 100 S. aureus/g.
• Si 1 résultat est supérieur à 100 CFU/g le lot est rejeté
(qualité microbiologique inacceptable).
• Si plus de 2 résultats se situent entre 10 et 100 le lot est rejeté.
• Si 0, 1 ou 2 résultats se situent entre 10 et 100 et les autres résultats
sont inférieurs à 10, le lot est considéré de qualité microbiologique
acceptable.
Les denrées alimentaires en cours de production doivent satisfaire
aux critères microbiologiques « d’hygiène du procédé » (critères
indicatifs à différentes étapes-clés de la production, indiquant la
bonne maitrise du procédé de production).

Pour pouvoir être mis sur le marché, les aliments et les denrées
alimentaires doivent satisfaire aux critères microbiologiques « de
sécurité » (critères impératifs définissant l’acceptabilité d’un lot de
denrée) Règlement CE 2073/2005

Chaque critère définit plusieurs paramètres : la catégorie de produit,


le microorganisme dénombré, la méthode analytique à utiliser
(méthode de référence), le stade d’application, le nombre
d’échantillons à analyser par lot de produit (n), l’éventuelle «
tolérance » (c) et, enfin, les limites de contamination (m et M).
2- Plan d’autocontrôle
c‘est l’ensemble des mesures prises par l’entreprise pour pouvoir
garantir la qualité et la conformité des denrées qu’elle produit (par
rapport aux exigences relatives tant à la sécurité alimentaire qu’à la
traçabilité).
Ce plan décrit, par exemple, les mesures de températures, la
traçabilité des matières premières, la désinfection des équipements
ou encore les analyses microbiologiques réalisées sur le produit final.
système d’autocontrôle obligatoire pour les entreprises
agroalimentaires.

3- Analyses microbiologiques
des analyses microbiologiques à réaliser sur les matières premières,
les surfaces et les produits finis.
Ces analyses doivent être décrites, par exemple en termes de
fréquence, de nombre d’échantillons à analyser et de limites
d’acceptation.
La plupart des critères microbiologiques préconisent l’analyse de cinq
échantillons par lot (« n » = 5). En routine, cela s’avère souvent
coûteux et peu justifié, surtout si la taille des lots est limitée
lors des analyses de routine, de nombreux laboratoires proposent de
réaliser les analyses sur un seul échantillon par lot et, en cas de
résultat douteux (compris entre « m » et « M »), d’analyser plusieurs
échantillons.

Il est, en effet, plus utile d’analyser un seul échantillon mais sur


différents paramètres (par exemple les germes totaux, les
entérobactéries, S. aureus, Clostridium perfringens et les
salmonelles) que d’analyser cinq échantillons sur un seul paramètre.
ISOLEMENT, PURIFICATION ET IDENTIFICATION DES
SOUCHES MICROBIENNES
Une souche microbienne: ensemble des individus issus d’un seul
microorganisme.

Une souche microbienne : formée par des individus identiques


appartenant à la même espèce.

Une souche microbienne: une partie d’une espèce microbienne.


Elle diffère des autres microbes de la même espèce par des
caractéristiques mineures mais identifiables.

Une souche microbienne : un groupe de microorganismes de la


même espèce possédant certains traits différentiels basés sur leur
parenté.
ISOLEMENT
I- Introduction
Isolement microbien: nécessaire pour toute étude des souches
microbiennes.

Buts possibles:
• Séparer les espèces microbiennes contenues dans un mélange
•Purifier les souches microbiennes
•Contrôler la pureté d’une souche microbienne dans un milieu
•Etudier les caractéristiques d’une souche microbienne

II- Culture microbienne


But: séparer en colonies distinctes (isolées) les microorganismes
présents dans le milieu.
Méthode: ensemencer le mélange (ou le produit) à examiner sur
des milieux de culture.
A- Les milieux de culture
Les caractéristiques et la composition des milieux de culture variables
le milieu à utiliser doit être choisi selon le but
le choix du milieu est important (pour favoriser le
développement des microbes à cultiver)

1- Composition du milieu
Le milieu doit contenir quantitativement et qualitativement toutes les
substances nutritives exigées pour la croissance des microorganismes.

La composition du milieu doit tenir compte des exigences


nutritionnelles des microorganismes (autotrophes ou hétérotrophes).

Selon la composition du milieu de culture, on distingue 2 types de


milieu: - milieux naturels
- milieux synthétiques
a- Milieux naturels ou empiriques
= des milieux préparés à partir de produits naturels et de
composition mal définie.

Les produits naturels les plus utilisés:


• L’extrait de viande: une infusion de viande de bœuf filtrée puis
concentrée contient des substances solubles dans l’eau
(glucides, composés azotés, vitamines hydrosolubles et sels
minéraux) mais de nature et de quantité inconnues.

•Les peptones: des produits de digestion chimique ou enzymatique


de matières protéiques (exples: viande, caséine, gélatine).
Selon le degré de dégradation des protéines: ils contiennent des
polypeptides (?), des oligopeptides (?), des tripeptides ((?), des
dipeptides (?) et/ou des acides aminés (?).
Il existe plusieurs variétés de peptones:
- Peptone pepsique (?)
-Peptone trypsique (?)
-Peptone papaïnique (?)
-Peptone pancréatique : provient de l’action de la pancréatine (?)

•Des sous-produits ou des résidus agro-alimentaires comme les


mélasses, la farine de soja ou de poisson ou de son, l’amidon de
maïs, le sirop de maltose (?).

Exemple de milieu naturel très simple mais très utilisé car permet
la croissance de la majorité des espèces bactériennes:
le bouillon nutritif dont la formule est:
Extrait de viande 5g
peptone trypsique10g
chlorure de sodium 5g
eau distillée 1000ml

Ce milieu peut aussi servir à la préparation d’autres milieux plus


spéciaux.
b- Milieux synthétiques ou chimiquement définis
Parmi ces milieux:
- des milieux à formule très simple et des milieux à formule
extrêmement complexe
- des milieux sur lesquels de nombreuses espèces
microbiennes peuvent se développer
- des milieux plus sélectifs (seule(s) une ou quelques espèces
bien définie(s) peuvent s’y développer)

Les milieux synthétiques ne sont utilisés que dans des cas


indispensables (car difficiles à préparer et prix élevé).

Remarque:
Lors du choix du milieu: considération de tous les facteurs
pouvant influencer la croissance microbienne et ils doivent
être favorables au développement des microorganismes.
2- Préparation du milieu
Les milieux de culture peuvent être:
•achetés, déjà conditionnés et prêts à l’emploi (surtout les milieux
complexes dont la préparation est délicate).
•préparés à partir de milieux secs déshydratés préparation simple,
rapide et pratiquement sans risque d’erreurs
•préparés à partir des différents ingrédients constitutifs
chaque détail de l’exécution de la « recette » à respecter.

Avant de préparer le milieu:


- Connaitre l’utilisation exacte (but de la manipulation)
-Rassembler tous les ingrédients nécessaires
- vérifier la nature et la qualité des produits selon la recette: nom,
forme (cristaux , poudre, liquide).
- Calculer les quantités et les volumes nécessaires (précision: ±0,1g et
si quantité en mg ±0,0001g).
a- Préparation du mélange:
Dans un récipient stérile assez grand pour contenir le volume
total de milieu
-Mettre le volume d’eau distillée stérile nécessaire
-Ajouter les ingrédients un par un dans l’ordre indiqué par la
recette

b-Homogénéisation:
-Agiter jusqu’à dissolution complète des ingrédients
-Si la dissolution doit se faire à chaud, porter le mélange à la
température indiquée jusqu’à fusion complète de tous les
ingrédients

c- Ajustement du pH:
- Si pH< au pH désiré, ajouter quelques gouttes de NaOH diluée
(au 1/100), mélanger et vérifier de nouveau (opération à
recommencer si nécessaire).
- Si pH>au pH désiré, ajouter quelques gouttes d’HCl dilué (au 1/20),
mélanger et vérifier de nouveau le pH (opération à recommencer si
nécessaire).

d- Filtration:
Si le milieu n’est pas limpide: à filtrer sur un grand filtre plissé en
papier spécial.
Si milieu gélosé (solide): filtration dans un endroit chauffant

e- Répartition:
Souvent, les milieux sont préparés en plus grande quantité que
nécessaire pour une seule culture microbienne répartition dans des
plus petits récipients avant leur stérilisation ou leur utilisation.

En microbiologie, pour une répartition en:


- tubes à essai : 5 à 7ml pour milieux solides et 9ml pour milieux
liquides
-petits flacons: 20ml pour milieux solides et 30ml pour milieux
liquides
- boîtes de Pétri: 15 à 20ml (milieux solides ) coulés en couche
mince

3- Stérilisation du milieu
La stérilisation permet de débarrasser un objet ou un produit de
tous les germes qu’il contient (destruction ou élimination de tous
les microbes présents au moment de l’opération).

Plusieurs procédés de stérilisation: procédés physiques (chaleur,


filtration, radiations) ou chimiques (antiseptiques, gaz
microbicides).
Choix d’une méthode de stérilisation en fonction de :
- la nature de l’objet ou du produit à stériliser
- la pollution présumée
- l’équipement disponible
a- Stérilisation par la chaleur
Les microbes sont très sensibles à la chaleur: la majorité tuée à 55-80°C
mais souvent les spores(?) survivent à l’ébullition
stérilisation des milieux de culture à des températures élevées pour
tuer tous les germes même les spores les plus thermorésistantes
170-180°C en chaleur sèche et 120°C en chaleur humide.
En général: stérilisation des milieux de culture par chaleur humide
(mort des microbes par destruction des enzymes et coagulation du
protoplasme).

 Stérilisation à une température>100°C (autoclavage):


Méthode la plus utilisée sauf pour les milieux contenant des substances
thermosensibles.
Dans l’autoclave (grand récipient métallique fermé hermétiquement):
l’eau du fond est chauffée à 115-120°C vapeur sous pression (la
surpression augmente l’efficacité de la chaleur) mort de tous les
germes même les spores après 20 à 40 min suivant la nature et le
volume à stériliser.
 Stérilisation à une température ≤ 100°C (ébullition):
Ebullition: un procédé très simple mais assure difficilement une
stérilisation efficace doit être maintenue assez longtemps (environ
1H) et à répéter 3 fois à 24H d’intervalle.
Peut-être faite: dans un stérilisateur spécial ou dans l’autoclave non
fermé hermétiquement.

Pour stériliser: les milieux peu contaminés, les milieux qui ne


supportent pas l’autoclavage et les milieux difficiles à filtrer.

b)Stérilisation par filtration:


Filtration stérilisante: pour les milieux de culture altérables à la
chaleur
Filtre = une paroi poreuse (une bougie en porcelaine ou une
membrane) qui peut retenir même les plus petits microbes.
Filtration facilitée en utilisant une pompe à vide qui aspire le milieu.
Remarques:
- Il faut stériliser un milieu de culture en respectant les indications dans
la formule
- Les milieux stérilisés doivent être fermés le plus hermétiquement
possible et stockés dans un endroit frais et obscur (réfrigérateur) si non
utilisé immédiatement après refroidissement.
- Après stérilisation, certains milieux solides en tube doivent être
refroidis en position inclinée une pente après refroidissement.

B- Dilutions
1-But
Un produit peut contenir de très nombreux microorganismes.
La dilution diminue le nombre de germes et facilite leur dissémination
lors de la culture.
Exemple:
Un produit contient 290 000 cellules bactériennes/cm3
La culture de 1ml (inoculum) ne permettra pas de compter les 290 000
colonies formant une seule nappe à la surface du milieu
dilution nécessaire pour obtenir des colonies isolées (si au 1/10 000
29 colonies sur la surface du milieu, après incubation.

2- Principe
En microbiologie: les dilutions utilisées sont des sous-multiples de
10
Exemples:
-au 1/10 = 10-1 ou diluer 10 fois
1ml de produit initial + 9ml de solvant = 10ml de solution finale
-au 1/100 = 10-2 ou diluer 100 fois
-souvent, on dilue jusqu’à 10-6
Le liquide de dilution (solvant=diluant) dépend du produit à diluer
(eau distillée, eau physiologique, eau peptonée, solution de Ringer…)

Si produit solide: préparation d’une suspension du produit (broyé si


nécessaire) dans un liquide préparation d’une dilution 10-1
Exemple: 1g de sol + 9ml d’eau distillée stérile = une solution finale à
10-1 (par convention, même si la masse volumique du produit n’est
3
3- Technique
Toutes les manipulations dans une zone aseptique (?) (15-20cm
autour d’une flamme) et les matériels stériles.
Méthode la plus utilisée: technique des dilutions décimales (1/10)
successives = dilutions en cascades de 10 en 10 à partir de la
solution initiale= produit pur.
1ml 1ml 1ml 1ml

9ml
de diluant
produit dilution dilution dilution dilution
pur=100 10-1 10-2 10-3 10-4
- bien agiter le tube avant prélèvement
-ne pas plonger la pipette de plus de 2cm de liquide
-ne pas aspirer le liquide
-verser le prélèvement sans plonger la pipette dans le liquide
C- Ensemencement
= opération consistant à porter(=cultiver) des germes microbiens
dans un milieu de culture

Doit être effectuer dans des conditions d’asepsie parfaite (absence


de tout autre germe que ceux qu’on veut cultiver):
manipulation dans une zone aseptique et tous les matériels
stérilisés
le manipulateur ne doit pas se déplacer pendant toute
l’opération

1- Technique d’ensemencement par épuisement (sur milieux solides)


Les milieux d’isolement = des milieux solides de composition simple
pouvant permettre le développement de nombreuses espèces
microbiennes.

Milieu le plus utilisé: la gélose nutritive (bouillon nutritif + agar=gélose)


Agar: un polyholoside(?) extrait de certaines algues marines, capable
de fixer de grande quantité d’eau (jusqu’à 100 fois son volume),
hydrosoluble à 100°C et se gélifie (se solidifie) à 40°C.

But de l’isolement: les germes disséminés à la surface du milieu se


développent des colonies distinctes (isolées) dont le nombre =
nombre de germes ensemencés

Technique de l’isolement:
• ensemencer la substance à étudier (la suspension de germes ou une
de ses dilutions) à la surface du milieu
• incuber la culture à température (environ 37°C à l’étuve) favorable à
la croissance des germes pendant 24-48H ou à température ambiante
pendant 2-3 jours.

a- Isolement dans des tubes


• Prélèvement , avec une anse de platine stérile = oese, d’un inoculum
à partir d’une suspension bactérienne
• Ensemencement d’un seul inoculum dans 3 tubes de gélose-pente
l’un après l’autre (sans stériliser ni recharger l’anse):

oese
= anse

stries serrées et parallèles

eau de
condensation
Anse chargée Ensemencement sur la pente en
posée à 1cm de remontant l’anse
l’eau de condensation

• chaque tube est fermé après l’ensemencement.


b- Isolement sur boîtes de Pétri
Par méthode des quadrants:
-Sur le fond externe de la boite contenant le milieu, on trace 2
diamètres perpendiculaires 4 quadrants à numéroter (1 à 4)
- Dépôt de l’inoculum (prélevé de la suspension microbienne) en un
point périphérique A situé dans le quadrant 1 (près de l’extrémité
du rayon séparant les quadrants 1 et 2)
2 techniques différentes peuvent être adoptées:
• 1ère technique:
1 A 2 2 B 3 3 C 4

1/4 1/4
tour tour
A B

3 4 1 4 2 A 1
-à partir de A: inoculum ensemencé sur les quadrants 1+2
-on ferme la boite et on la fait tourner d’un quart de tour
quadrants 2 +3
-On referme la boite et on la fait tourner d’un quart de tour
-À partir du point C: ensemencement avec l’anse non rechargée sur les
quadrants 3+4
• 2ème technique:
1 2 - à partir de A jusqu’au centre de la boite
A l’inoculum est disséminé sur une série de stries
serrées mais seulement dans le quadrant 1
- l’opération est recommencée dans le quadrant 2
(sans stériliser ni recharger l’anse) puis dans
3 4 quadrant 3 puis 4
Les colonies seront isolées dans le(s) dernier(s) quadrant(s)

Par méthode de quadrillage:


L’inoculum est disséminé sur la surface du
milieu sur une série de traits parallèles puis sur une 2ème
série de traits parallèles qui sont perpendiculaires à la 1ère
série

Remarque: chaque boite ensemencée est refermée puis


immédiatement retournée avant l’incubation
2- Exemples de méthodes particulière d’isolement
Isolement à la surface du milieu: pas toujours applicable

Exemple: pour isolement de germes anaérobies strictes


culture en profondeur dans milieux solides
multiplication et isolement

Technique:
faire fondre le milieu gélosé par ébullition prolongée pour éliminer le
gaz (O2) dissous
• Isolement sur boites de Pétri:
-milieu refroidi mais encore liquide (environ 45°C) + inoculum
-Homogénéisation du mélange
-Répartition dans plusieurs boites
-Refroidissement à température ambiante (20-25°C) avant incubation
- observation des colonies isolées par transparence de la gélose
• Isolement dans des tubes (6 à 10 tubes):
-Répartition de la gélose bouillante dans les tubes
-Refroidissement jusqu’à 45°C (milieu encore liquide)
-On plonge l’anse chargée à 1cm du fond du 1er tube
-Sans faire de bulles d’air, on remonte l’anse en décrivant un spirale
-À 2 cm de la surface, l’anse est retirée verticalement et on ferme le
tube
-Sans stériliser ni recharger l’anse, on recommence rapidement
l’opération dans le 2ème tube et ainsi de suite
- Refroidissement rapide des tubes (à l’eau courante) avant
l’incubation dans des conditions d’anaérobiose (dans récipient
spéciale=jarre(?)
PURIFICATION

La purification d’une souche microbienne nécessite au préalable la


caractérisation précise des colonies isolées obtenues après isolement

I- Caractérisation ou repérage
= observation à l’œil nu ou à la loupe des caractères morphologiques
des microorganismes = étude des caractères culturaux = étude de
l’aspect macroscopique des colonies.

Lors de l’isolement: Chaque individu microbien ensemencé donne


après croissance, une descendance groupée en une colonie visible à
l’œil nu.

La caractérisation est effectuée dans les cultures comportant des


colonies parfaitement isolées les unes des autres.
Plusieurs critères des colonies isolées sont observés:
- la taille approximative: la taille maximale d’un type de colonie
peut varier légèrement d’une colonie à l’autre
- la forme avec:
• l’allure du contour: régulier ou irrégulier (dentelé, déchiqueté…)
• le relief: surface bombée ou plate ou ombiliquée (centre creux) ou
centre surélevé
-l’aspect de la surface: lisse et brillante (colonie type S = smooth(?))
ou mate et rugueuse (type R = rough(?)). Différences dues à la
composition chimique de la paroi bactérienne ou à la présence de
capsule(?)
- la coloration: la plupart des colonies n’a pas de couleur bien définie
(blanchâtre, jaunâtre ou grisâtre). Pourtant, certaines bactéries
élaborent des pigments une teinte franche (jaune, rouge, violette)
et parfois le milieu lui-même est coloré par le pigment.
- La consistance: en prélevant on distingue des colonies muqueuses,
filantes, grasses, crémeuses, poudreuses…
Une observation à la loupe binoculaire peut compléter la caractérisation
d’une colonie des renseignements supplémentaires sur le relief et
l’aspect de la surface.

La caractérisation permet de déterminer le nombre de types de


colonies présents dans le milieu.

II- Cultures pures


Les différents types de colonies doivent être isolés les uns des autres (=
purification) un ré-isolement de chaque type

Technique de purification:
- pour chaque type de colonie: choisir une colonie bien isolée
- prélever une petite parcelle (de la taille d’une tête d’épingle) de la
colonie choisie
-diluer et bien mélanger le prélèvement avec 1ml d’eau distillée stérile
dans un petit tube stérile
-marquer chaque tube (exple: type 1)
-prendre un échantillon de chaque tube et faire un examen sous
microscope toutes les cellules microbiennes doivent être
identiques
- prélever 2 gouttes de chaque tube et diluer dans un autre petit tube
contenant 1ml d’eau distillée stérile (une dilution)
- effectuer un isolement à partir de cette dilution sur 2 tubes de
gélose pente

Après incubation: les cultures ne doivent contenir qu’un seul type de


colonies des populations homogènes appelées cultures pures =
souches pures

Une souche est constituée par des germes identiques appartenant à


une et une seule espèce microbienne

Sur une souche pure: possibilité de faires des études


microbiologiques (exples: identification, études des caractéristiques…)
III- Conservation des cultures pures
Toutes études des microorganismes: nécessitent l’utilisation de souches
pures dans les laboratoires: conservation de cultures pures de
différentes espèces microbiennes (déjà identifiées ou à identifier).

Les souches pures servent de souches de référence pour


l’enseignement, la recherche ou la production industrielle
d’un intérêt capital doivent être maintenues pures au fil du
temps (conservation de toutes leurs propriétés)
Plusieurs méthodes de conservation des souches pures:

A- Conservation à 4°C
Une culture pure peut être conservée à l’abri de la lumière au
réfrigérateur.
Ce procédé de stockage: de courte durée car après quelques semaines,
de nombreuses caractéristiques des souches disparaissent et des
mutations peuvent avoir lieu les souches doivent être transférées
périodiquement sur des milieux neufs (repiquages successifs).
Remarques:
-Fermer soigneusement les tubes pour éviter la dessiccation des
cultures
- En général, le milieu de conservation est une gélose nutritive
inclinée

B- Congélation
Pour pouvoir bien conserver les structures cellulaires des souches, ce
procédé est conditionné par plusieurs paramètres dont les plus
importants sont:
- le choix de la température de congélation
- la vitesse d’abaissement à la température choisie

Méthode : congeler les souches pures (suspensions microbiennes) à


la température la plus basse (souvent à -80°C) et d’y parvenir le plus
rapidement possible.
L’addition d’agents chimiques appelés « cryoprotecteurs » permet
d’éviter les altérations cellulaires dues au refroidissement mais ces
produits sont plus efficace si la vitesse de congélation plus faible.

Les souches congelées sont ensuite conservées sous azote liquide


(-196°C) ou sous vapeur d’azote (-120°C).

Avant toute utilisation des souches conservées:


- décongeler le plus vite possible
- remettre en culture

C- Lyophilisation
= un procédé de conservation des produits biologiques par
dessiccation sous vides à basse température.

Dans le lyophilisateur: Les suspensions microbiennes sont d’abord


congeler (-60 à -80°C) puis mises sous vide (abaissement de la
pression)
Pression (mm de Hg)
103
102 SOLIDE fusion
LIQUIDE
101
100 X point triple distillation= vaporisation

10-1 sublimation= lyophilisation


10-2 GAZ
10-3
-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 Température (en °C)

L’abaissement de la pression en-dessous du point triple


sublimation de la glace (passage de l’état solide à l’état gazeux
sans passer par l’état liquide) un produit sec solide = lyophilisat

Les souches microbiennes lyophilisées gardent leurs propriétés


biologiques très longtemps (des années). Elles sont remises en
culture, dans un milieu liquide, avant leur utilisation.
IDENTIFICATION

Importante lors de l’étude des microorganismes surtout pour


déterminer les germes responsables des maladies.
Effectuée à partir des cultures pures et nécessite plusieurs étapes :

I- Examen à l’état frais


Les microorganismes des souches pures disposés entre lame et lamelle :
observés sous microscope sans artifice de préparation
observation des germes à l’état vivant
mise en évidence de leur morphologie, leur mode de groupement
et leur mobilité.
Les lames utilisées : bien dégraissées et mouillables (?)

A- Prélèvement
= un très petit échantillon de la souche pure à identifier
- L’anse chargée est mouillée avec une goutte d’eau distillée stérile
déposée sur la lame mince
- Homogénéisation du mélange
- dépôt d’une lamelle propre sur la préparation (sans faire de bulles
d’air)
- répartition de la préparation en appuyant légèrement sur la lamelle
(avec l’extrémité d’une pince mais jamais avec la pulpe du doigt)
- si débordement, absorber avec un papier filtre

B- Lutage
Consiste à border la lamelle d’un produit solidifiable appelé lut
(paraffine, vernis, peinture à séchage rapide…) qui empêche toute
entrée d’air:
assurer une fixation de la lamelle sur la lame
éviter une dessiccation rapide de la préparation et une
contamination par des germes pathogènes

Lutage obligatoire pour l’observation des germes anaérobies stricts.


C- Observation
Voir sous microscope:
- La forme des cellules microbiennes en se rappelant que l’examen
est faite à travers une certaine épaisseur de liquide
des germes identiques peuvent apparaitre différents suivant
l’angle d’observation
- Le mode de groupement des cellules microbiennes:
cellules isolées, groupées par 2 ou par 4, en amas ou en chaînette
-La mobilité = motilité des germes : présence ou absence de flagelles.
Un germe mobile se déplace avec un mouvement qui lui est propre
plusieurs germes mobiles se déplacent dans des directions
différentes (mobilité à ne pas confondre avec les mouvements
possibles du liquide qui entraînent tous les germes dans le même
sens).
Un germe mobile est caractérisé par le nombre, la localisation et le
mode de groupement des flagelles.
II- Coloration
L’étude précise de la morphologie des microorganismes et parfois de
leur structure, exige leur fixation sur lame et leur coloration
plusieurs types de coloration:
- colorations simples
- colorations complexes
- colorations spéciales

Généralement, une coloration est effectuée sur un frottis (?).

Les étapes pour faire un frottis:


- Etalement
Etalement du prélèvement (à partir d’un milieu liquide) effectué avec
l’anse stérilisée sur une lame mince bien dégraissée.
Prélèvement étalé en une couche mince et régulière par un
mouvement circulaire spirales de 2-3cm de diamètre partant du
centre vers l’extérieur puis de l’extérieur vers le centre.
-Séchage
Un frottis bien étalé sur une lame propre est déjà presque sec
Un frottis sec a une surface mate (non brillante)
On peut sécher un frottis en posant la lame sur une plaque chauffante
à 37°C ou à quelques cm d’une flamme

Remarque: la mauvaise qualité d’une coloration provient souvent


d’un séchage à haute température (altération de certains constituants
de la cellule microbienne).

-Fixation
C’est le procédé qui consiste à tuer les germes et à les fixer sur la
lame sans altérer leur structure.
Une lame fixée se conserve longtemps et ne présente pas de danger.
Plusieurs méthodes de fixation existent mais la technique la plus
utilisée est «la fixation à l’alcool flambé»:
- le frottis sec est recouvert d’alcool pendant 30 secondes
- La lame est ensuite bien égouttée puis séchée pour éliminer l’alcool
restant soit par passage rapide 3 fois sur la flamme avec le frottis vers
le haut, soit laissée à l’air libre le temps nécessaire.
- la lame refroidie doit être rincée à l’eau et égouttée avant d’être
colorée

A- Coloration au bleu de méthylène (une coloration simple)


Bleu de méthylène: permet de colorer presque toutes les bactéries
Le frottis fixé est :
- recouvert totalement avec le bleu de méthylène filtré pendant 30s à
1min
- lavée abondamment à l’eau puis séché entre 2 feuilles de papier
filtre(sans frotter)
- observé sous microscope avec un objectif à immersion (?)

B- Coloration Gram (une coloration complexe)


C’est la coloration de base de la bactériologie.
Une double coloration permettant de différencier les bactéries d’après
leur forme et leur affinité pour les colorants

- coloration: Les bactéries (le frottis) sont imprégnées par une solution
de violet de gentiane pendant 30s à 1 min
- mordançage: le violet de gentiane est enlevé par une solution iodo-
iodurée = lugol qui sert de mordant(?). Le lugol doit agir pendant 30s
puis renouvelé 3 fois.
- décoloration: le frottis est lavé à l’alcool pendant au moins 30s pour
éliminer toute trace de colorant. La lame est ensuite bien rincée à
l’eau.
La paroi bactérienne, selon sa composition chimique, peut être
perméable ou non au passage de l’alcool
les cellules bactériennes sont non décolorées (Gram positif) et
restent violet ou sont décolorées (Gram négatif) et deviennent
incolores.
- recoloration: la lame est recouverte par une solution de fuschine ou
de safranine diluée au 10ème pendant 10-30s puis rincée à l’eau et
séchée délicatement entre 2 feuilles de papier filtre. Ce 2ème colorant
colore les bactéries incolores (Gram -) dans le ton rose-rouge.
- observation: sous objectif à immersion
Selon les bactéries à examiner (culture pure ou non), on pourra mettre
en évidence:
• des bactéries toutes semblables (une seule espèce = une souche)
même forme et même couleur (Gram+ ou Gram-).
• des bactéries différentes (plusieurs espèces = plusieurs souches) : 3
possibilités :
- formes différentes et coloration différentes
- formes différentes et colorations semblables
- formes semblables et colorations différentes (Gram+ et Gram- qui
ne sont pas distingués par une coloration simple)

Remarque:
La coloration Gram repose sur des différences (chimiques et
fonctionnelles) entre la paroi des bactéries Gram+ et Gram- (?)
la paroi des Gram+ forme une barrière qui empêche le passage
de l’alcool
La paroi des Gram- autorise le passage de l’alcool qui décolore le
cytoplasme

C- Coloration à l’encre de Chine (une coloration spéciale)


Les colorations spéciales permettent la mise en évidence de certains
détails de la structure microbienne (capsule, flagelles, spores,
granulations de réserve…)
Coloration à l’encre de Chine mise en évidence de la présence ou
l’absence de capsule (?) chez les bactéries et les levures (?).

Technique:
- au centre d’une lame bien dégraissée, on dépose à 1cm l’une de
l’autre : une goutte du produit à examiner et une goutte plus petite
d’encre de Chine
- on recouvre la lame d’une lamelle en évitant de faire des bulles d’air
- on fait ou non un lutage
Observation: sous objectif à immersion
La préparation présente 3 zones:
- un côté (où l’on a déposé le produit) dans lequel on observe des
germes à l’état frais
- un côté opposé (où l’on a déposé l’encre) complètement noir
- une zone intermédiaire où les 2 liquides se mélangent. C’est la zone
à observer
le fond de la préparation est gris foncé et les cellules microbiennes
apparaissent plus claires
la présence de capsule se traduit par des halos lumineux qui
entourent les cellules

III- Etude des caractères antigéniques


Surtout pour identifier les bactéries lors d’une infection.
On peut faire soit un:
A- Sérotypage
Consiste à rechercher les antigènes(?)spécifiques d’une bactéries
(exprimés dans le malade)
Les bactéries (microbes) sont caractérisées par leurs Ag .
L’étude des ces Ag permet de classer en sérotype les bactéries
appartenant à la même espèce Chaque sérotype est caractérisé par une
mosaïque d’Ag si présence de ces Ag identification de l’espèce
un grand intérêt diagnostique et épidémiologique

Technique:
Ag inconnus mis en contact avec une batterie d’anticorps (immunsérums)
connus agglutination (Ag-Ac) quand les Ag sont en présence de leurs
Ac spécifiques.

B- Sérodiagnostic
Consiste à détecter dans le sérum d’un malade les Ac apparus à la suite
d’une infection.
Au cours d’une infection, le malade élabore des Ac = agglutinines
spécifiques aux Ag de la bactérie pathogène.
Technique:
Sérum du malade contenant les Ac circulants inconnus mis en contact
avec l’espèce bactérienne (donc des Ag connus) supposée
responsable de l’infection agglutination (Ag-Ac) si la bactérie
pathogène appartienne à la même espèce.

IV- Lysotypie
Présence de structure spécifique sur la paroi de certaines espèces
bactériennes capacité de fixer des virus appelés bactériophages
infection virale de ces bactéries suivie de la lyse des cellules.

Existe une spécificité entre l’espèce de bactériophage et l’espèce


bactérienne qu’elle peut infecter une infection lytique indique
l’identité de la bactérie (identification par lysotypie)

Technique:
Le germe à identifier mis en contact avec une batterie de
bactériophages .
Mélange (le germe inconnu + un bactériophage connu) ensemencé
en nappe à la surface d’un milieu solide présence de plages de lyse
= zones transparentes stériles dans le tapis bactérien, s’il y a infection
identification de l’espèce bactérienne.

V- Génotypie
Utilisation de la taxonomie génétique pour identifier les microbes.
Une souche microbienne est caractérisée par ses caractéristiques
génétiques étude de son ADN permet de connaitre son
génotype (type de génome) classification de la souche après
comparaisons avec les caractéristiques génétiques des espèces
connues identification de la souche.

Trois critères sont généralement étudiés en taxonomie génétique:


- le GC% = coefficient de Chargaff
- le taux d’hybridation
- la séquence des ARN ribosomaux
Actuellement, ces études sont souvent complétées par
l’établissement de cartes génétiques par utilisation des enzymes de
restriction + amplification des gènes + électrophorèse des produits
d’amplification

A- Coefficient de Chargaff
L’ADN natif caractérisé par son hyperchromicité due à :
-L’arrangement régulier et parallèle des paires de bases le long de la
double hélice
- chaque paire de base = un dipôle (couple) qui absorbe faiblement
la lumière à 260 nm (UV).
chaque ADN natif possède une valeur de DO à 260 nm qui
dépend de la nature des bases constitutives et du nombre de paires
de bases
dénaturation
ADN natif agent dénaturant (coupure des liaisons H
(ADN double brin) (exple: la chaleur) entre les paires de bases
ADN simples brins)
modification structurale de l’ADN qui se traduit par une
augmentation de l’absorption UV (DO augmente) qu’on appelle effet
hyperchromique ou hyperchrome

Effet hyperchrome : DO= f (température)

DO à 260nm

simples brins

doubles brins
Tm Température en °C
Tm (temperature melting) ou température moyenne de transition :
correspond à une augmentation de l’absorbance égale à 50% de
l’absorbance maximale

Valeur de Tm dépend du taux respectifs des bases dans l’ADN car :


T° pour couper les triples liaisons H des paires de bases GC > T° pour
couper les doubles liaisons H des paires AT

La relation entre valeur de Tm et taux des bases détermination


du GC% = coefficient de Chargaff qui est une information de grand
intérêt en taxonomie génétique:
- deux espèces microbiennes ayant des GC% différents n’ont pas de
communauté génétique entre elles
- deux espèces ayant les mêmes séquences nucléotidiques dans
leur génome ont le même GC% dans leur ADN
- mais deux espèces ayant GC% identiques n’ont pas
obligatoirement les mêmes séquences nucléotidiques et peuvent
être génétiquement très éloignées l’une de l’autre.
-Tous les microbes appartenant à la même espèces doivent avoir le
même GC%

B- Hybridation ADN/ADN
C’est une technique qui consiste:
2 brins d’ADN renaturation in-vitro un hétéroduplex
hétérologues (ADN bicaténaire)

Il est possible de définir le degré d’homologie dans l’hétéroduplex =


ressemblance entre les séquences nucléotidiques entre les 2 brins
provenant de 2 espèces différentes = % de séquences
complémentaires = % de ré-association par rapport aux séquences
totales
Exemples:

25% d’hybridation 50% d’hybridation 100% d’hybridation


Quelque soit la méthode utilisée, l’hybridation est une mesure
indispensable pour l’analyse taxonomique microbienne surtout pour
l’identification d’une espèce nouvelle ou d’un genre nouveau

Remarque:
Actuellement, la définition de l’espèce microbienne sur le plan
génomique repose sur 3 critères: GC% , taux d’hybridation et taille du
génome.

C- Séquence des ARN ribosomaux


Selon Woese, les ARNr : les meilleurs et les plus précis des
«chronomètre moléculaires» par la constance de leurs fonctions et
leur répartition dans les organismes vivants.
Leur taille permet de les séquencer rapidement par une enzyme
appelée la transcriptase réverse.
Il existe 3 sortes d’ARNr:
- l’ARN 23S = le grand ARNr avec environ 2900 nucléotides
- l’ARN 16S = le petit ARNr avec 1540 nucléotides
-l’ARN 5S = le très petit ARNr avec 120 nucléotides

L’ARNr 16S : la molécule la plus stable et la plus analyser car l’ARNr 23S
trop donc difficile à caractériser tandis que l’ARNr 5S présente parfois
dans sa séquence des anomalies.

ARNr 16S enzyme = ribonucléase T1 courts fragments


(hydrolyse partielle) oligonucléotidiques
(jusqu’à 20 bases)

Séquençage des courts fragments donne des produits = des


séquences de nucléotides à analyser selon un langage dont les
« mots » sont les séquences de nucléotides (avec 6 bases ou plus) qui
se répètent dans la molécule d’ARNr 16S.
si 2 organismes A et B contiennent 1 ou plusieurs « mots »
semblables ils sont apparentés
un arbre généalogique représentant des parentés et des filiations
entre les souches microbiennes
B- Cartographie génétique
Après extraction et purification de l’ADN de la souche à étudiée, on
traite l’ADN avec des enzymes de restriction les produits obtenus =
fragments nucléotidiques séparés et analysés par électrophorèse en
gel d’agarose établissement de la carte de restriction de la souche ou
de sa carte génétique (une sorte de carte d’identité du génome
permettant d’identifier la souche.
Une carte génétique montre l’alignement linéaire des gènes (séquence
de bases) sur un chromosome
représentation d’un génome

VI- Etude des caractères chimiques


Consiste en l’analyse des microbes ou de leurs composants en utilisant
de données chimiques (obtenues par application de techniques
physico-chimiques) pour identifier les souches microbiennes
chimiotaxonomie
Exemples chez les bactéries:
A- Composition de la paroi
Le composant de base (caractéristique) de la paroi de la plupart des
procaryotes est un polymère appelé le peptidoglycane = la muréine.
Cependant , la composition chimique de la paroi varie selon les
groupes de bactéries (Gram+ et Gram-) l’analyse de cette
composition détermination du groupe de bactéries

De plus, chez les Gram+, dans la paroi, la nature :


- des acides aminés varie (un critère taxonomique)
détermination du nom de genre
- des oses varie (un critère taxonomique) nom de l’espèce

B- Profils protéiniques
Les protéines d’un organisme vivant sont obtenues après expression
des caractères génétiques donc codées par des gènes (ADN)
des organismes étroitement apparentés doivent posséder en
communs des protéines identiques ou voisines.
L’électrophorèse d’un extrait de cellule de la souche à identifier
détection des protéines (taches) qui permettent d’avoir le profil
protéinique de la souche
Le profil protéinique est le reflets précis des potentialités génétiques
de chaque souche (un critère taxonomique pour identifier l’espèce)

C- Composition lipidique
La nature des lipides présents dans une souche microbienne peut
être utilisée pour identifier des groupes et même des genres de
bactéries comme:
- Les lipides en quantité plus importante dans la paroi des Gram- par
rapport aux Gram+
- la composition en acides gras dans les cellules bactériennes
(exemple: présence des acides mycoliques (?) est spécifique du genre
Mycobacterium)
- les lipides polaires (?) surtout les phospholipides (?) et les
glycolipides (?) sont caractéristiques de certains actinomycètes et
corynébactéries
-Les quinones isopréniques (?) = une classe de lipides terpéniques
localisée dans la membrane de certaines bactéries.
Le type de quinone présent ou absent est un critère taxonomique
détermination du groupe de bactéries et parfois même l’espèce.

VII- Etude des caractères biochimiques


L’identification des microorganismes repose en grande partie sur leurs
caractères biochimiques qui sont les traduction de leur métabolisme
détermination du nom de genre ou d’espèce.

Les souches sont cultivées sur des milieux spécifiques mise en


évidence, par des indicateurs colorés, de l’existence ou l’absence
d’une ou de plusieurs réactions enzymatiques caractéristiques
d’une espèce ou d’un genre de bactéries.

Exemples de milieux d’identification:


A- Milieux d’étude du métabolisme énergétique

1- Milieu viande-foie
Permet l’identification selon le mode de respiration du microbe.
Ce milieu solide présente une variation continue du potentiel d’oxydo-
réduction (?) un gradient de concentration en oxygène dissous
qui diminue de + en + jusqu’au fond du tube :
- une souche aérobie stricte se développe dans la partie
supérieure du milieu
- une souche anaérobie stricte se développe au fond du tube
- une souche aéro-anaérobie ou anaéro-aérobie se multiplie dans
tout le tube

2- Milieu citrate de Simmons


Ce type de milieu permet de déterminer la nature des substrats
utilisés par les germes comme source d’énergie et de carbone (et
parfois aussi d’azote) multiplication d’une souche qui métabolise
le substrat .
Le milieu citrate de Simmons (solide en pente) contient du citrate de
sodium comme substrat une souche qui se multiplie sur le milieu
métabolise ce substrat (la coloration du milieu vire du jaune au bleu)

B- Milieux d’étude du métabolisme glucidique

1- Milieu Hajna-Kligler
Milieu solide à base de glucose et de lactose mais contient aussi des
protéines:
multiplication de la souche cultivée indique l’existence de
fermentation des glucides (la coloration du milieu vire du jaune au bleu
soit: - fermentation du lactose (fermentation lactique (?))
multiplication de la souche en surface
- fermentation du glucose (fermentation alcoolique(?))
multiplication de la souche au fond du tube
Ce milieu permet aussi de détecter la production d’H2S provenant de la
désulfuration(?) des acides aminés soufrés présence de trainées
noires.
2- Milieu mannitol-mobilité
Milieu gélosé mi-solide permettant de détecter :
- la fermentation du mannitol(?) par une souche production
d’acides diminution du pH du milieu virage du rouge au jaune
- la mobilité des germes des poussées de germes en dehors de la
ligne d’ensemencement

C- Milieu d’étude du métabolisme protidique

Milieu urée-indole
Milieu liquide contenant de l’urée et du tryptophane, permettant de
révéler:
- La dégradation de l’urée présence d’uréase (virage du jaune au
rouge)
- La dégradation du tryptophane en indole présence de la
tryptophanase apparition d’un anneau rouge à la surface

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