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ANALYSES BIOLOGIQUES
ET
MICROBIOLOGIQUES
4 Crédits
I-Introduction
Les analyses microbiologiques permettent de mettre en évidence et
de quantifier les germes présents dans un produit.
ces analyses ne sont pas seulement qualitatives mais aussi
quantitatives.
il est donc important de connaître la charge microbienne du
produit (quantification des germes présents).
selon les types de germes présents et leur nombre respectif,
l’analyse en laboratoire permet de valider que le produit correspond
aux exigences et respecte la réglementation en vigueur.
Produit de Catégorie 2
Préparations pour application locale ou pour administration
dans les voies respiratoires
- Bactéries aérobies viables : < 102
- Champignons : < 102
- Entérobactéries : < 102
- Pseudomonas aeruginosa : absence
- Staphylococcus aureus : absence
Produit de Catégorie 3B
Préparations pour administration orale contenant
des matières premières d’origine naturelle, lorsqu’un
pré-traitement antimicrobien est impossible et que les matières
premières peuvent avoir une contamination tolérable (103 UFC/g ou
/10 ml)
- Bactéries aérobies viables : < 104
- Champignons : < 102
- Entérobactéries : < 102
- Staphylococcus aureus : absence
- E. coli : absence
-Salmonella : absence pour 10 g ou 10 mL
IV- Méthodes de dénombrement :
A-Méthodes directes :
*Le comptage direct des cellules se fait au microscope à l’aide d’un
hématimètre appelé Lame de Thoma
(c’est une lame munie au centre d’un quadrillage de dimensions
bien déterminées)
* Epifluorescence :
Les bactéries sont colorées par un fluorochrome (Orange d’acridine
ou Erythrosine), puis observées au microscope en lumière UV.
Cette méthode permet de compter sélectivement les bactéries
vivantes fluorescentes à une couleur différente des cellules mortes.
*Compteur de particules :
Cet appareil réalise automatiquement le dénombrement des
particules ou cellules en suspension dans une solution, grâce aux
modifications de résistances électriques qu’elles provoquent à leur
passage à travers un orifice calibré.
B-Méthodes indirectes :
Le dénombrement se base sur l’évaluation de la biomasse
produite après culture et incubation dans des conditions
favorables soit par :
*Mesure de la masse après culture sur milieu de culture liquide :
La biomasse peut être évaluée par pesée du poids sec après
filtration et séchage) ou par mesure de la densité du trouble (DO
au spectrophotomètre: la valeur de la DO est toujours
proportionnelle à la quantité de biomasse dans le milieu)
* Mesure de l’activité des bactéries, en suivant la cinétique de
disparition d’un substrat ou celle de l’apparition d’un produit final.
*Mesure du nombre de bactéries :
- Dilution et dénombrement en milieu de culture solide
-Estimation du nombre le plus probable (NPP)
a. En surface
Le milieu gélosé est pré-coulé dans des boîtes de Pétri
Ensemencement :
Le dénombrement en surface s’effectue sur 0,1 mL de dilution.
• Homogénéiser la dilution à prélever (la plus grande).
• Prélever l’inoculum (volume précis) et le déposer au centre de la
surface de la gélose.
• Étaler à l’aide d’une pipette râteau ou d’un étaleur plastique le
volume sur toute la surface du milieu.
b- Dans la masse avec ou sans double couche
Les milieux gélosés adéquats sont liquéfiés et maintenus en
surfusion à 65 °C.
20 mL de milieu par boîte de Pétri en une seule couche ou avec:
- 15 mL pour la 1ère couche
- 5 mL pour la 2nde couche
Incubation
La température d’incubation sera indiquée sur le compte-rendu ou
sur un papier placé sur les boîtes et est variable suivant les micro-
organismes à dénombrer (exemple : coliformes totaux à 30°C,
coliformes thermotolérants à 44°C).
c- Lecture et interprétation
Le comptage des UFC ne doit pas être réalisé au hasard mais de
manière méthodique Il est conseillé de délimiter des
ensembles au marqueur sur le fond de la boîte de Pétri (exemple:
toutes les 20 UFC comptées)
Conclusion :
Concentration en micro-organismes dans le produit pur
comprise entre 103 et 104 microorganismes par mL.
103 ≤ [N] < 104 micro-organismes par mL.
résultats + + + + + + +
Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)
Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de
résultats +
Regroupement
Grouper le nombre de résultats positifs par dilution
Dilutions 100 10-1 10-2 10-3 10-4
Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)
Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de
3 3 2 1 0
résultats +
Regroupement
Regrouper en nombre de 3 chiffres la suite de chiffres
obtenue en commençant par le chiffre obtenu par la plus
faible dilution.
Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)
Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de
3 3 2 1 0
résultats +
Regroupement 332 321 210 - -
Choix de la dilution pour le calcul, 2 méthodes sont
possibles :
Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)
Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de
3 3 2 1 0
résultats +
Regroupement 332 321 210 - -
Lire la valeur du NPP dans la table de Mac Grady et en
déduire la concentration des bactéries dans l’échantillon :
Nombre de tubes Nombre de tubes
positifs au niveau positifs au niveau
des 3 taux de NPP des 3 taux de NPP
dilution retenus dilution retenus
000 < 0,3 230 2,9
001 0,3 300 2,3
010 0,3 301 4
020 0,6 302 6
100 0,4 310 4
101 0,7 311 7
110 0,7 322 12
111 1,1 320 9
120 1,1 321 15
121 1,5 322 21
200 0,9 323 29
201 1,4 330 20
210 1,5 331 50
211 2,0 332 110
220 2,1 333 >110
221 2,8
- choix de la dilution : 10-1
- Détermination du NPP : regroupement choisi = 321 et
dans la table de Mac Grady le NPP correspondant à 321 est
15.
- Calcul :
NPP
N Fd
Vensemencé
15
N 101 150 1,5.102 coliformes / mL
1
ANALYSES MICROBIOLOGIQUES DES AMBIANCES ET SURFACES
I. INTRODUCTION
Les ambiances (air intérieur à un espace fermé) et les surfaces,
comme tous les milieux de l’environnement , présentent une
contamination microbiologique permanente mais variable dans le
temps et dans l’espace, donc renferment une flore
microbienne diversifiée, d’origines humaine et environnementale.
IV. CONTAMINATION DE L’EAU
La dégradation de la qualité microbiologique de l’eau peut survenir à
tout moment entre le lieu de production et le robinet de l’utilisateur.
Cette dégradation peut être liée à une prolifération de
microorganismes naturellement présents dans l’eau, voire à une
contamination dans les réservoirs, dans les canalisations publiques
ou dans les réseaux intérieurs de distribution des bâtiments.
V. CONTAMINATION DE L’AIR
La contamination microbiologique de l’air a pour origine la formation
d’un bioaérosol (ensemble de fines particules en suspension dans
l’air) complexe qui peut contenir plusieurs contaminants
biologiques : micro-organismes vivants (bactéries, virus, levures,
moisissures), fragments microbiens antigéniques, toxines et/ou
autres substances d’origine microbienne.
1 Sources de contamination
Les réservoirs microbiens de l’air sont classiquement distingués en
réservoirs vivants, c’est-à-dire les personnes présentes dans le local,
et en réservoirs environnementaux.
Dans ces réservoirs de l’environnement, on retrouve les micro-
organismes saprophytes (bactéries et champignons microscopiques)
qui sont très résistants dans le milieu extérieur, et certains germes
pathogènes ou commensaux d’origine humaine qui survivent bien en
dehors de leur organisme-hôte.
2 Amplification microbienne
La multiplication active des micro-organismes, présents dans les
réservoirs, se produit lorsqu’il existe une infection chez un individu ou
lorsque sont réunies, dans un réservoir environnemental, toutes les
conditions nutritives, physico-chimiques et (micro)biologiques
nécessaires à la croissance de ces micro-organismes.
Selon son activité, une personne émet par minute, une quantité
impressionnante de particules, d’un diamètre moyen de 0,5 micron.
A savoir :
- 100 000 particules microbiennes : assis, sans activités ;
- 1 000 000 p. : assis ou debout, avec mouvements des bras, des
jambes, de la tête et du corps ;
- 5 000 000 p. : pendant une marche normale ;
- 10 000 000 p. : pendant une marche accélérée.
L’ évaluation quantitative:
comptage électronique des particules qui apprécient le degré de la
pollution.
Le compteur détecte les particules de 0,3 à 20 microns à la lumière
blanche et de 0,12 à 10 microns au rayonnement laser.
Un contrôle régulier évaluation du degré de la contamination
du local et celui engendré par le personnel et les machines en
mouvement.
L’évaluation qualitative:
analyse d’un certain volume d’air en vue d’un comptage et d’une
identification biologique après mise en culture.
Le recueil des bactéries s’obtient par sédimentation sur boites de
Pétri, méthode simple et peu coûteuse ; ou par l’emploi de capteur
et collecteur d’air, technique mieux adaptée à la surveillance
rigoureuse de la décontamination d’un local.
Il existe actuellement un grand nombre d’activités pour lesquelles, un
environnement ‘HORS GERMES” est souhaitable, du fait des
risques que les microorganismes peuvent engendrer.
VII. CONCLUSION
Les méthodes de prélèvement et d’analyse microbienne dans les
milieux de l’environnement (air, surfaces, eau) ont fait l’objet de
nombreux travaux afin d’améliorer la collecte, la quantification et
l’identification des microorganismes.
Les efforts ont été plus marqués pour les prélèvements d’air avec le
développement de nouveaux capteurs et biocollecteurs une
meilleure évaluation de l’exposition humaine ou de produits
industriels.
Remarques:
- Le problème majeur actuel se situe au niveau de la fiabilité des
résultats. En effet, beaucoup de paramètres peuvent les influencer
(état physiologique des souches, protocole de réalisation du test,
niveau d’ensemencement,...).
- la mise en œuvre du challenge test suppose par ailleurs d’être faite
avec un minimum de déontologie et d’harmonisation. C’est
pourquoi, il s’agit avant tout d’un outil scientifique d’étude au
service des fabricants de produits et non un outil de contrôle.
LES ETAPES DE LA REALISATION DES CHALLENGE TESTS
(Notermans et al., 1993)
1. description du test :
- Approche de l’expérience
- Reproductibilité/répétabilité
- Sécurité
2. inoculation:
- Choix de l’inoculum
- Méthode de conservation des souches
- Préparation de l’inoculum
- Taille de l’inoculum
- Méthode d’inoculation
3. réalisation du test:
- Temps et température d’incubation
- Taille du prélèvement et fréquence
- Procédure
4. interprétation des résultats
ANALYSES MICROBIOLOGIQUES DES COSMETIQUES, PHYTOMEDICAMENTS ET AROMES
I GENERALITES
1 MICROORGANISMES RECHERCHÉS.
• La présence de micro-organismes peut
Réduire l’efficacité des principes actifs
Induire des problèmes de santé
2.6.12. Contrôle microbiologique des produits non stériles :essais de dénombrement microbien ....................
2.6.13. Contrôle microbiologique des produits non stériles :recherche de microorganismes spécifies..............
ANCIENS CRITÈRES.
La limite prescrite dans la contamination microbienne dans des produits non
obligatoirement stériles est
102 micro-organismes par ml ou par gramme.
Limite maximale d'acceptation 5.102 micro-organismes par mL ou par gramme.
• Si absence totale de développement, rendre < à 1 micro-organisme par ml ou par
gramme.
• Si développement, choisir le résultat le plus défavorable.
– Si le résultat est > 102 micro-organismes par ml ou par gramme, réaliser une coloration
de Gram.
• si bacilles Gram +, faire une recherche de spores et pas d'identification.
• si bacilles Gram-, faire une identification.
• si coques Gram +, faire une identification.
La conformité ou la non conformité du produit dépend du micro-organisme identifié et du traitement appliqué
au produit.
– Si le résultat est > 5.102 micro-organismes par ml ou par gramme, effectuer un deuxième
essai sur le même échantillon et éventuellement un troisième essai sur un échantillon
différent du même lot.
• Si le deuxième essai est bon, rendre comme résultat: produit conforme; de même pour le troisième essai.
• Si un des deux essais terminaux est non conforme, le produit est rejeté.
5.1.4. Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques et des
3 CRITÈRES D’ACCEPTATION. (PH Eu 8.0 2014)
substances pour usage pharmaceutique non stériles (5.8.)
Orale : préparation non aqueuse 103 102 Escherichia coli (1g ou 1 mL)
http://www.eprofeel.tv/v
/102,charles-river-le-dos
age-des-endotoxines.htm
l
C) CONTRÔLES QUALITÉ.
• Afin de valider les contrôles sur les lots de fabrication, il est nécessaire de
vérifier la conformité :
- des milieux
- des diluants
- des produits à examiner.
• Les tests réalisés sont :
- des tests de stérilité des milieux et diluants:
ils permettent de contrôler leur non contamination lors de leur préparation et de leur
conservation en les plaçant (milieu prêt à l’emploi donc conditionné en boite et non ensemencé) à
l’étuve pendant le temps et à la température d’incubation utilisés habituellement.(voir TP)
- des tests de fertilité des milieux :
- ils permettent de déterminer si le milieu a conservé les qualités nutritionnelles attendues au cours
de sa préparation ou de sa conservation.
- On ensemence le milieu avec une suspension bactérienne de référence (ATCC) de concentration
connue de façon à retrouver environ 100 colonies sur le milieu.(voir TP)
- L’absence de culture ou un résultat < 30 colonies traduit un problème de fertilité.
- des tests permettant de vérifier l’absence d’antimicrobien dans le produit
examiné.
- Il consiste à mettre en contact le produit avec les souches de référence et de comparer les résultats
obtenus avec un témoin réalisé sans produit.(voir TP)
Interprétation des résultats
Dossier de lot ANALYSES
Enquête
Retraitement
Libération de Destruction
lot du lot
II) COSMETIQUES
1- Législation
Les produits cosmétiques devraient être sûrs dans des conditions
d’utilisation normales ou raisonnablement prévisibles:
Obligation de respecter les Bonne Pratique de Fabrication (PBF) :
norme NF EN ISO 22 716
2- Risques microbiologiques
Appréciation du risque microbiologique (norme ISO
29621:2010)
c) conditionnement:
- dénombrement et détection de la flore mésophile
aérobie (FMA ou FAMT = flore aérobie mésophile totale)
- dénombrement des levures /moisissures
- détection des pathogènes
- détection des micro-organismes spécifiés et non
spécifiés
4- Contrôle des produits finis
a) Préparation de la suspension mère :
le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation et le moment où
l’inoculum entre en contact avec le milieu de culture ne doit pas
dépasser 45 min
La suspension mère est préparée à partir d’un échantillon d’au moins
1 g ou 1 ml du produit d’essai mélangé avec soin.
préparation d’une dilution 10-1
- Produit miscible à l’eau
9 mL de diluant-neutralisant + S (g ou ml) de produit
- Produit non miscible à l’eau
9 mL de diluant neutralisant + polysorbate 80 + S (g ou ml) de
produit
S = quantité
b) Neutralisation des propriétés antimicrobiennes d’un produit
Composés chimiques pouvant neutraliser
Conservateur l'activité antimicrobienne des conservateurs
Polysorbate 80
parabens, phénoxyéthanol, phényléthanol,
Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras
etc.
Aldéhydes
Glycine, histidine
Agents générateurs de formaldéhyde
c) Dénombrement et détection
En plus du dénombrement , une détection est également réalisée
dans un bouillon « d’enrichissement » incubé pendant 20H.
Bouillon Eugon LT 100
Bouillon pour enrichissement
Légende du tableau
- DGAT = dénombrement des germes aérobies viables totaux
- DMLT = dénombrement des moisissures et levures totales
- UFC = unités formant des colonies
Voie d’administration DGAT (UFC / DMLT (UFC / g ou Micro-organismes spécifiés
g ou UFC / UFC / mL)
mL)
Voie orale : préparations non 103 102 Absence d’Escherichia coli (dans 1 g ou 1 mL)
aqueuses
Voie orale : préparations 102 101 Absence d’Escherichia coli (dans 1 g ou 1 mL)
aqueuses
Voie rectale 103 102 -
Cela signifie qu’il faut analyser 5 échantillons par lot et que ces
échantillons doivent contenir moins de 10 Staphylococcus aureus/g,
avec toutefois une tolérance de 2 échantillons pouvant se trouver
entre 10 et 100 S. aureus/g.
• Si 1 résultat est supérieur à 100 CFU/g le lot est rejeté
(qualité microbiologique inacceptable).
• Si plus de 2 résultats se situent entre 10 et 100 le lot est rejeté.
• Si 0, 1 ou 2 résultats se situent entre 10 et 100 et les autres résultats
sont inférieurs à 10, le lot est considéré de qualité microbiologique
acceptable.
Les denrées alimentaires en cours de production doivent satisfaire
aux critères microbiologiques « d’hygiène du procédé » (critères
indicatifs à différentes étapes-clés de la production, indiquant la
bonne maitrise du procédé de production).
Pour pouvoir être mis sur le marché, les aliments et les denrées
alimentaires doivent satisfaire aux critères microbiologiques « de
sécurité » (critères impératifs définissant l’acceptabilité d’un lot de
denrée) Règlement CE 2073/2005
3- Analyses microbiologiques
des analyses microbiologiques à réaliser sur les matières premières,
les surfaces et les produits finis.
Ces analyses doivent être décrites, par exemple en termes de
fréquence, de nombre d’échantillons à analyser et de limites
d’acceptation.
La plupart des critères microbiologiques préconisent l’analyse de cinq
échantillons par lot (« n » = 5). En routine, cela s’avère souvent
coûteux et peu justifié, surtout si la taille des lots est limitée
lors des analyses de routine, de nombreux laboratoires proposent de
réaliser les analyses sur un seul échantillon par lot et, en cas de
résultat douteux (compris entre « m » et « M »), d’analyser plusieurs
échantillons.
Buts possibles:
• Séparer les espèces microbiennes contenues dans un mélange
•Purifier les souches microbiennes
•Contrôler la pureté d’une souche microbienne dans un milieu
•Etudier les caractéristiques d’une souche microbienne
1- Composition du milieu
Le milieu doit contenir quantitativement et qualitativement toutes les
substances nutritives exigées pour la croissance des microorganismes.
Exemple de milieu naturel très simple mais très utilisé car permet
la croissance de la majorité des espèces bactériennes:
le bouillon nutritif dont la formule est:
Extrait de viande 5g
peptone trypsique10g
chlorure de sodium 5g
eau distillée 1000ml
Remarque:
Lors du choix du milieu: considération de tous les facteurs
pouvant influencer la croissance microbienne et ils doivent
être favorables au développement des microorganismes.
2- Préparation du milieu
Les milieux de culture peuvent être:
•achetés, déjà conditionnés et prêts à l’emploi (surtout les milieux
complexes dont la préparation est délicate).
•préparés à partir de milieux secs déshydratés préparation simple,
rapide et pratiquement sans risque d’erreurs
•préparés à partir des différents ingrédients constitutifs
chaque détail de l’exécution de la « recette » à respecter.
b-Homogénéisation:
-Agiter jusqu’à dissolution complète des ingrédients
-Si la dissolution doit se faire à chaud, porter le mélange à la
température indiquée jusqu’à fusion complète de tous les
ingrédients
c- Ajustement du pH:
- Si pH< au pH désiré, ajouter quelques gouttes de NaOH diluée
(au 1/100), mélanger et vérifier de nouveau (opération à
recommencer si nécessaire).
- Si pH>au pH désiré, ajouter quelques gouttes d’HCl dilué (au 1/20),
mélanger et vérifier de nouveau le pH (opération à recommencer si
nécessaire).
d- Filtration:
Si le milieu n’est pas limpide: à filtrer sur un grand filtre plissé en
papier spécial.
Si milieu gélosé (solide): filtration dans un endroit chauffant
e- Répartition:
Souvent, les milieux sont préparés en plus grande quantité que
nécessaire pour une seule culture microbienne répartition dans des
plus petits récipients avant leur stérilisation ou leur utilisation.
3- Stérilisation du milieu
La stérilisation permet de débarrasser un objet ou un produit de
tous les germes qu’il contient (destruction ou élimination de tous
les microbes présents au moment de l’opération).
B- Dilutions
1-But
Un produit peut contenir de très nombreux microorganismes.
La dilution diminue le nombre de germes et facilite leur dissémination
lors de la culture.
Exemple:
Un produit contient 290 000 cellules bactériennes/cm3
La culture de 1ml (inoculum) ne permettra pas de compter les 290 000
colonies formant une seule nappe à la surface du milieu
dilution nécessaire pour obtenir des colonies isolées (si au 1/10 000
29 colonies sur la surface du milieu, après incubation.
2- Principe
En microbiologie: les dilutions utilisées sont des sous-multiples de
10
Exemples:
-au 1/10 = 10-1 ou diluer 10 fois
1ml de produit initial + 9ml de solvant = 10ml de solution finale
-au 1/100 = 10-2 ou diluer 100 fois
-souvent, on dilue jusqu’à 10-6
Le liquide de dilution (solvant=diluant) dépend du produit à diluer
(eau distillée, eau physiologique, eau peptonée, solution de Ringer…)
9ml
de diluant
produit dilution dilution dilution dilution
pur=100 10-1 10-2 10-3 10-4
- bien agiter le tube avant prélèvement
-ne pas plonger la pipette de plus de 2cm de liquide
-ne pas aspirer le liquide
-verser le prélèvement sans plonger la pipette dans le liquide
C- Ensemencement
= opération consistant à porter(=cultiver) des germes microbiens
dans un milieu de culture
Technique de l’isolement:
• ensemencer la substance à étudier (la suspension de germes ou une
de ses dilutions) à la surface du milieu
• incuber la culture à température (environ 37°C à l’étuve) favorable à
la croissance des germes pendant 24-48H ou à température ambiante
pendant 2-3 jours.
oese
= anse
eau de
condensation
Anse chargée Ensemencement sur la pente en
posée à 1cm de remontant l’anse
l’eau de condensation
1/4 1/4
tour tour
A B
3 4 1 4 2 A 1
-à partir de A: inoculum ensemencé sur les quadrants 1+2
-on ferme la boite et on la fait tourner d’un quart de tour
quadrants 2 +3
-On referme la boite et on la fait tourner d’un quart de tour
-À partir du point C: ensemencement avec l’anse non rechargée sur les
quadrants 3+4
• 2ème technique:
1 2 - à partir de A jusqu’au centre de la boite
A l’inoculum est disséminé sur une série de stries
serrées mais seulement dans le quadrant 1
- l’opération est recommencée dans le quadrant 2
(sans stériliser ni recharger l’anse) puis dans
3 4 quadrant 3 puis 4
Les colonies seront isolées dans le(s) dernier(s) quadrant(s)
Technique:
faire fondre le milieu gélosé par ébullition prolongée pour éliminer le
gaz (O2) dissous
• Isolement sur boites de Pétri:
-milieu refroidi mais encore liquide (environ 45°C) + inoculum
-Homogénéisation du mélange
-Répartition dans plusieurs boites
-Refroidissement à température ambiante (20-25°C) avant incubation
- observation des colonies isolées par transparence de la gélose
• Isolement dans des tubes (6 à 10 tubes):
-Répartition de la gélose bouillante dans les tubes
-Refroidissement jusqu’à 45°C (milieu encore liquide)
-On plonge l’anse chargée à 1cm du fond du 1er tube
-Sans faire de bulles d’air, on remonte l’anse en décrivant un spirale
-À 2 cm de la surface, l’anse est retirée verticalement et on ferme le
tube
-Sans stériliser ni recharger l’anse, on recommence rapidement
l’opération dans le 2ème tube et ainsi de suite
- Refroidissement rapide des tubes (à l’eau courante) avant
l’incubation dans des conditions d’anaérobiose (dans récipient
spéciale=jarre(?)
PURIFICATION
I- Caractérisation ou repérage
= observation à l’œil nu ou à la loupe des caractères morphologiques
des microorganismes = étude des caractères culturaux = étude de
l’aspect macroscopique des colonies.
Technique de purification:
- pour chaque type de colonie: choisir une colonie bien isolée
- prélever une petite parcelle (de la taille d’une tête d’épingle) de la
colonie choisie
-diluer et bien mélanger le prélèvement avec 1ml d’eau distillée stérile
dans un petit tube stérile
-marquer chaque tube (exple: type 1)
-prendre un échantillon de chaque tube et faire un examen sous
microscope toutes les cellules microbiennes doivent être
identiques
- prélever 2 gouttes de chaque tube et diluer dans un autre petit tube
contenant 1ml d’eau distillée stérile (une dilution)
- effectuer un isolement à partir de cette dilution sur 2 tubes de
gélose pente
A- Conservation à 4°C
Une culture pure peut être conservée à l’abri de la lumière au
réfrigérateur.
Ce procédé de stockage: de courte durée car après quelques semaines,
de nombreuses caractéristiques des souches disparaissent et des
mutations peuvent avoir lieu les souches doivent être transférées
périodiquement sur des milieux neufs (repiquages successifs).
Remarques:
-Fermer soigneusement les tubes pour éviter la dessiccation des
cultures
- En général, le milieu de conservation est une gélose nutritive
inclinée
B- Congélation
Pour pouvoir bien conserver les structures cellulaires des souches, ce
procédé est conditionné par plusieurs paramètres dont les plus
importants sont:
- le choix de la température de congélation
- la vitesse d’abaissement à la température choisie
C- Lyophilisation
= un procédé de conservation des produits biologiques par
dessiccation sous vides à basse température.
A- Prélèvement
= un très petit échantillon de la souche pure à identifier
- L’anse chargée est mouillée avec une goutte d’eau distillée stérile
déposée sur la lame mince
- Homogénéisation du mélange
- dépôt d’une lamelle propre sur la préparation (sans faire de bulles
d’air)
- répartition de la préparation en appuyant légèrement sur la lamelle
(avec l’extrémité d’une pince mais jamais avec la pulpe du doigt)
- si débordement, absorber avec un papier filtre
B- Lutage
Consiste à border la lamelle d’un produit solidifiable appelé lut
(paraffine, vernis, peinture à séchage rapide…) qui empêche toute
entrée d’air:
assurer une fixation de la lamelle sur la lame
éviter une dessiccation rapide de la préparation et une
contamination par des germes pathogènes
-Fixation
C’est le procédé qui consiste à tuer les germes et à les fixer sur la
lame sans altérer leur structure.
Une lame fixée se conserve longtemps et ne présente pas de danger.
Plusieurs méthodes de fixation existent mais la technique la plus
utilisée est «la fixation à l’alcool flambé»:
- le frottis sec est recouvert d’alcool pendant 30 secondes
- La lame est ensuite bien égouttée puis séchée pour éliminer l’alcool
restant soit par passage rapide 3 fois sur la flamme avec le frottis vers
le haut, soit laissée à l’air libre le temps nécessaire.
- la lame refroidie doit être rincée à l’eau et égouttée avant d’être
colorée
- coloration: Les bactéries (le frottis) sont imprégnées par une solution
de violet de gentiane pendant 30s à 1 min
- mordançage: le violet de gentiane est enlevé par une solution iodo-
iodurée = lugol qui sert de mordant(?). Le lugol doit agir pendant 30s
puis renouvelé 3 fois.
- décoloration: le frottis est lavé à l’alcool pendant au moins 30s pour
éliminer toute trace de colorant. La lame est ensuite bien rincée à
l’eau.
La paroi bactérienne, selon sa composition chimique, peut être
perméable ou non au passage de l’alcool
les cellules bactériennes sont non décolorées (Gram positif) et
restent violet ou sont décolorées (Gram négatif) et deviennent
incolores.
- recoloration: la lame est recouverte par une solution de fuschine ou
de safranine diluée au 10ème pendant 10-30s puis rincée à l’eau et
séchée délicatement entre 2 feuilles de papier filtre. Ce 2ème colorant
colore les bactéries incolores (Gram -) dans le ton rose-rouge.
- observation: sous objectif à immersion
Selon les bactéries à examiner (culture pure ou non), on pourra mettre
en évidence:
• des bactéries toutes semblables (une seule espèce = une souche)
même forme et même couleur (Gram+ ou Gram-).
• des bactéries différentes (plusieurs espèces = plusieurs souches) : 3
possibilités :
- formes différentes et coloration différentes
- formes différentes et colorations semblables
- formes semblables et colorations différentes (Gram+ et Gram- qui
ne sont pas distingués par une coloration simple)
Remarque:
La coloration Gram repose sur des différences (chimiques et
fonctionnelles) entre la paroi des bactéries Gram+ et Gram- (?)
la paroi des Gram+ forme une barrière qui empêche le passage
de l’alcool
La paroi des Gram- autorise le passage de l’alcool qui décolore le
cytoplasme
Technique:
- au centre d’une lame bien dégraissée, on dépose à 1cm l’une de
l’autre : une goutte du produit à examiner et une goutte plus petite
d’encre de Chine
- on recouvre la lame d’une lamelle en évitant de faire des bulles d’air
- on fait ou non un lutage
Observation: sous objectif à immersion
La préparation présente 3 zones:
- un côté (où l’on a déposé le produit) dans lequel on observe des
germes à l’état frais
- un côté opposé (où l’on a déposé l’encre) complètement noir
- une zone intermédiaire où les 2 liquides se mélangent. C’est la zone
à observer
le fond de la préparation est gris foncé et les cellules microbiennes
apparaissent plus claires
la présence de capsule se traduit par des halos lumineux qui
entourent les cellules
Technique:
Ag inconnus mis en contact avec une batterie d’anticorps (immunsérums)
connus agglutination (Ag-Ac) quand les Ag sont en présence de leurs
Ac spécifiques.
B- Sérodiagnostic
Consiste à détecter dans le sérum d’un malade les Ac apparus à la suite
d’une infection.
Au cours d’une infection, le malade élabore des Ac = agglutinines
spécifiques aux Ag de la bactérie pathogène.
Technique:
Sérum du malade contenant les Ac circulants inconnus mis en contact
avec l’espèce bactérienne (donc des Ag connus) supposée
responsable de l’infection agglutination (Ag-Ac) si la bactérie
pathogène appartienne à la même espèce.
IV- Lysotypie
Présence de structure spécifique sur la paroi de certaines espèces
bactériennes capacité de fixer des virus appelés bactériophages
infection virale de ces bactéries suivie de la lyse des cellules.
Technique:
Le germe à identifier mis en contact avec une batterie de
bactériophages .
Mélange (le germe inconnu + un bactériophage connu) ensemencé
en nappe à la surface d’un milieu solide présence de plages de lyse
= zones transparentes stériles dans le tapis bactérien, s’il y a infection
identification de l’espèce bactérienne.
V- Génotypie
Utilisation de la taxonomie génétique pour identifier les microbes.
Une souche microbienne est caractérisée par ses caractéristiques
génétiques étude de son ADN permet de connaitre son
génotype (type de génome) classification de la souche après
comparaisons avec les caractéristiques génétiques des espèces
connues identification de la souche.
A- Coefficient de Chargaff
L’ADN natif caractérisé par son hyperchromicité due à :
-L’arrangement régulier et parallèle des paires de bases le long de la
double hélice
- chaque paire de base = un dipôle (couple) qui absorbe faiblement
la lumière à 260 nm (UV).
chaque ADN natif possède une valeur de DO à 260 nm qui
dépend de la nature des bases constitutives et du nombre de paires
de bases
dénaturation
ADN natif agent dénaturant (coupure des liaisons H
(ADN double brin) (exple: la chaleur) entre les paires de bases
ADN simples brins)
modification structurale de l’ADN qui se traduit par une
augmentation de l’absorption UV (DO augmente) qu’on appelle effet
hyperchromique ou hyperchrome
DO à 260nm
simples brins
doubles brins
Tm Température en °C
Tm (temperature melting) ou température moyenne de transition :
correspond à une augmentation de l’absorbance égale à 50% de
l’absorbance maximale
B- Hybridation ADN/ADN
C’est une technique qui consiste:
2 brins d’ADN renaturation in-vitro un hétéroduplex
hétérologues (ADN bicaténaire)
Remarque:
Actuellement, la définition de l’espèce microbienne sur le plan
génomique repose sur 3 critères: GC% , taux d’hybridation et taille du
génome.
L’ARNr 16S : la molécule la plus stable et la plus analyser car l’ARNr 23S
trop donc difficile à caractériser tandis que l’ARNr 5S présente parfois
dans sa séquence des anomalies.
B- Profils protéiniques
Les protéines d’un organisme vivant sont obtenues après expression
des caractères génétiques donc codées par des gènes (ADN)
des organismes étroitement apparentés doivent posséder en
communs des protéines identiques ou voisines.
L’électrophorèse d’un extrait de cellule de la souche à identifier
détection des protéines (taches) qui permettent d’avoir le profil
protéinique de la souche
Le profil protéinique est le reflets précis des potentialités génétiques
de chaque souche (un critère taxonomique pour identifier l’espèce)
C- Composition lipidique
La nature des lipides présents dans une souche microbienne peut
être utilisée pour identifier des groupes et même des genres de
bactéries comme:
- Les lipides en quantité plus importante dans la paroi des Gram- par
rapport aux Gram+
- la composition en acides gras dans les cellules bactériennes
(exemple: présence des acides mycoliques (?) est spécifique du genre
Mycobacterium)
- les lipides polaires (?) surtout les phospholipides (?) et les
glycolipides (?) sont caractéristiques de certains actinomycètes et
corynébactéries
-Les quinones isopréniques (?) = une classe de lipides terpéniques
localisée dans la membrane de certaines bactéries.
Le type de quinone présent ou absent est un critère taxonomique
détermination du groupe de bactéries et parfois même l’espèce.
1- Milieu viande-foie
Permet l’identification selon le mode de respiration du microbe.
Ce milieu solide présente une variation continue du potentiel d’oxydo-
réduction (?) un gradient de concentration en oxygène dissous
qui diminue de + en + jusqu’au fond du tube :
- une souche aérobie stricte se développe dans la partie
supérieure du milieu
- une souche anaérobie stricte se développe au fond du tube
- une souche aéro-anaérobie ou anaéro-aérobie se multiplie dans
tout le tube
1- Milieu Hajna-Kligler
Milieu solide à base de glucose et de lactose mais contient aussi des
protéines:
multiplication de la souche cultivée indique l’existence de
fermentation des glucides (la coloration du milieu vire du jaune au bleu
soit: - fermentation du lactose (fermentation lactique (?))
multiplication de la souche en surface
- fermentation du glucose (fermentation alcoolique(?))
multiplication de la souche au fond du tube
Ce milieu permet aussi de détecter la production d’H2S provenant de la
désulfuration(?) des acides aminés soufrés présence de trainées
noires.
2- Milieu mannitol-mobilité
Milieu gélosé mi-solide permettant de détecter :
- la fermentation du mannitol(?) par une souche production
d’acides diminution du pH du milieu virage du rouge au jaune
- la mobilité des germes des poussées de germes en dehors de la
ligne d’ensemencement
Milieu urée-indole
Milieu liquide contenant de l’urée et du tryptophane, permettant de
révéler:
- La dégradation de l’urée présence d’uréase (virage du jaune au
rouge)
- La dégradation du tryptophane en indole présence de la
tryptophanase apparition d’un anneau rouge à la surface