Fluorometra

Por: Q.F. Manuel Valle Campos

Luminiscencia Molecular
Concepto.-Con este trmino se conocen 3 tipos de mtodos opticos relacionados entre s, en donde las mleculas del analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisin es capaz de suministrar informacin para realizar analisis cualitativos y cuantitativos. Tambin existe otras formas de obtener luminiscencia a partir de otros tipos de energa como por ejemplo: La electroluminiscencia que se puede apreciar en los fluorescentes que sirven para iluminar los hogares

Clasificacin
Los fenomenos luminscentes opticos se pueden clasificar en: A.- Fotoluminiscentes: Cuando la luminiscencia se consigue mediante la absorcin de fotones. A su vez esta se puede dividir en: 1.- Fluorescencia 2.- Fosforescencia B.- Quimioluminiscentes o Quimioluminiscencia: Basado en que el espectro de emisin de una especie excitada es formado en el curso de una reaccin qumica, cuando esta reaccin es producida por seres vivos al fenomeno se le conoce como Bioluminiscencia

Ventajas
Los fenomenos luminiscentes presentan las siguientes ventajas: 1.-Sensibilidad.- Los espectros de emisin son de 1 a 3 rdenes de magnitud inferiores a los encontrados en la espectroscopia de absorcin. 2.-Lmite de deteccin.- Se pueden realizar analisis a nivel de ppb a ppm. 3.-Intervalos de linealidad.- Son muchos mayores que los mtodos de absorcin.

Fluorescencia
INTRODUCCIN.-La fluorescencia es un proceso de emisin en el cual las molculas son excitadas por la absorcin de radiacin electromagntica. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energa en forma de fotones. Una de las caractersticas ms atractivas de los mtodos de fluorescencia es su sensibilidad inherente, la cual es, con frecuencia, de uno a tres ordenes de magnitud mejor que las de la Espectroscopia de absorcin. No obstante, los mtodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los mtodos de absorcin debido al nmero relativamente limitado de sistemas qumicos que se pueden hacer fluorecer.

Estados Excitados
El principio de exclusin de Pauli establece que en un tomo no pueden haber 2 electrones con los 4 nmeros cuanticos iguales, por lo que en un orbital no hay ms de 2 electrones y adems los 2 deben tener los estados de espn opuestos, cuando esto ocurre los espines estn apareados. Debido a este apareamiento las molculas son diamagneticas en cambio los radicales libres al tener un electrn desapareado son paramagneticas

Estado Singulete y Triplete

En un estado electrnico fundamental cuando todos los espines se encuentran apareados se le llama singulete. Cuando uno de los electrones de una molecula es excitado y promocionado a un nivel energetico superior pero sigue apareado estamos en presencia de un estado singulete, pero si al ser promocionado este electrn se desaparea entonces hablaremos de un estado triplete

Velocidades de Absorcin y de Emisin

La velocidad de absorcin de un fotn es de 10-15 a 10-14 s. En la emisin fluorescente el tiempo de vida del estado excitado es de 10-9 a 10-7 s en cambio en la fosforescencia la emisn de enrega radiante requiere tiempo entre 10-4 a 10 s o ms esto se debe que las absortividades molares son inversamente a la velocidades de absorcin.

Procesos de Desactivacin
Una molecula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una combinacin de varias etapas: - Relajacin Vibracional - Conversin Interna - Conversin Externa -Cruce entre sistemas - Fosforescencia -Relajacin Vibracional.-Es un proceso por el cual la energa vibracional se pierde como consecuencia de las colisiones entre las molculas de la especie excitada y el disolvente.

Resultando una pequea transferencia de energa y un incremento pequeo de la temperatura . Cuando se produce la fluorescencia la banda de emisin se desplazar hacia longitudes de onda mayores ( Desplazamiento de Stokes) - Conversin Interna.- Describe los procesos intermoleculares por los cuales la molcula pasa a un estado electronico de ms baja energa sin emisin de radiacin. Se pueden producir dos fenomenos: a) Predisociacin b) Disociacin

a) Predisociacin.- Es el movimiento del electrn desde un estado electrnico ms alto hacia un nivel vibracional superior de un estado electrnico ms bajo y tiene la energa vibracional suficiente como para provocar la ruptura de un enlace. b) Disociacin.-En este fenomeno la radiacin absorbida excita al electrn de un cromoforo a un nivel vibracional suficientemente alto para provocar la ruptura del enlace del grupo cromoforo. - Cruce entre Sistemas.- Es un proceso en el cual se invierte el espn de un electrn excitado y da como resultado un cambio en la multiplicidad de la molcula originando un estado singulete/triplete que favorece a la fosforescencia.

La presencia de tomos pesados (Pb, I, Br) o especies paramagneticas en la disolucin como el oxgeno molecular favorecen el cruce de sistemas. - Fosforescencia.-Un estado electronico excitado tambin puede incluir la fosforescencia que se produce luego de un cruce de sistemas. Este tipo de emisin solo se puede observar a bajas temperaturas y en medios altamente viscosos o por molculas que estn adsorbidas sobre superficies slidas.

Tipos de Fluorescencia
Los fenomenos fluorescentes pueden ser de dos tipos: 1.- Fluorescencia de Resonancia.- Cuando la emisin de la energa radiante es igual a la energa radiante absorbida, se presenta en vapores de compuestos metlicos.Ejemplo el Sodio absorbe a 5896 y 5890 ngstrom y emite en las mismas longitudes de onda. 2.- Desplazamiento de Stokes.- Se produce cuando las longitudes de onda de emisin se presentan en ondas ms largas que las de absorcin.

VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA

1.- Rendimiento cuntico: El rendimiento cuntico o la eficacia cuntica de la fluorescencia es simplemente las relacin entre el nmero de molculas que emiten fluorescencia respecto al nmero total de molculas excitadas. Las molculas altamente fluorescentes, por ejemplo, la fluoresceina, tienen eficiencias cunticas que, en ciertas condiciones, se aproximan a la unidad. Las especies no fluorescentes tienen eficiencias que son prcticamente cero. El rendimiento cuantico va ha estar fuertemente influenciado por factores como la estructura qumica y el entorno del analito

2.- Tipo de transiciones.- La emisin fluorescente rara vez es consecuencia de la absorcin de radiacin U.V. a longitudes de onda menores de 250 nm, debido a su gran poder energetico que puede producir la desactivacin de los estados excitados por predisociacin o disociacin . La mayora de compuestos fluorescentes la radiacin se produce por transiciones n *o * 3.- Estructura: La fluorescencia ms intensa y la ms til es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromticos. Los compuestos que contienen estructuras alifticas y alicclicas de carbonilo o estructuras con dobles enlaces muy conjugados pueden presentar tambin fluorescencia.

 La mayora de los hidrocarburos aromticos no sustituidos son fluorescentes en disolucin, la eficacia cuntica aumenta con el nmero de anillos y con su grado de conjugacin. La sustitucin en un anillo aromtico causa desplazamientos en la longitud de onda de absorcin mxima y los cambios correspondientes en los picos de fluorescencia. Adems, la sustitucin afecta frecuentemente la eficiencia de la fluorescencia. As compuestos heterciclicos sencillos como la piridina, furano, tiofeno y pirrol no son fluorescentes, pero si a estos compuestos se le condensan anillos bencnicos se acota el tiempo de vida del estado excitado y se observa la fluorescencia, por ejemplo, quinolina, isoquinolina, indol.

Si en el anillo bencenico se producen sustiticiones por la introduccin de halogenos se producen cambios en el pico de fluorescencia as como en la eficacia, esto se debe por el efecto del tomo pesado. Si se le adiciona un cido carboxilico o un grupo carbonilo en el anillo aromatico se inhibe la fluorescencia. 4.- Rigidez estructural: Empricamente se encuentra que la fluorescencia est particularmente favorecida en molculas que poseen estructuras rgidas. Por ejemplo, las eficacias cunticas para el fluoreno y el bifenilo estn prximas a 1,0 y 0,2, respectivamente, bajo condiciones similares de medida.Esto se debe al puente que forma el grupo metileno en el fluoreno.

 La influencia de la rigidez tambin tiene importancia en el aumento de la fluorescencia de ciertos quelantes orgnicos cuando estn formando un complejo con un ion metlico. Por ejemplo, la fluorescencia de la 8- hidroxiquinolena es mucho menor que la de su complejo con zinc:

5.- Temperatura y disolvente: La eficacia cuntica de la fluorescencia disminuye en muchas molculas con el aumento de la temperatura, ya que el aumento de la frecuencia de las colisiones a temperatura elevada hace aumentar la probabilidad de desactivacin no radiante (conversin externa ).

Una disminucin en la viscosidad del disolvente tambin aumenta la probabilidad de conversin externa y produce el mismo resultado. Si los disolventes tienen tomos pesados dentro de su estructura estos producen cambios en el espn-orbital que llevan al aumento en la velocidad de formacin del triplete y la disminucin de la fluorescencia, por lo que basta con incorporar disolventes con tomos pesados para que la molecula fluorescente pase ha ser fosforescente.

 6.- Efecto del pH: La fluorescencia de un compuesto aromtico con sustituyentes cidos o bsicos en el anillo depende normalmente del pH. Tanto la longitud de onda como la intensidad de emisin son probablemente diferentes para la forma ionizada y no ionizada del compuesto. Por lo tanto ser muy frecuente en los mtodos fluorimtricos el control estricto del pH.

Espectros de Emisin y de Excitacin

Espectro de Excitacin.- Se obtiene midiendo la intensidad luminiscente a una longitud de onda fija mientras se vara la longitud de onda de excitacin. Espectro de Emisin o Fluorescente.-Se obtiene manteniendo una longitud de excitacin fija y se va recorriendo las longitudes de onda de la emisin fluorescente, este fenomeno se va ha apreciar en un ngulo de 90 grados con respecto a la fuente de radiacin.

INSTRUMENTACIN
Los equipos se conocen como fluorometros y espectrofluorometros. Pueden ser de un solo haz y de doble haz por lo que se pueden utilizar tanto para analisis cuantitativos y cualitativos respectivamente. Dentro de los componentes de estos equipos podemos utilizar: Fuentes: En la mayora de las aplicaciones se necesita una fuente ms intensa que las lmparas de volframio o de deuterio utilizadas para la medida de absorcin. Esto se debe, como qued demostrado anteriormente a que la magnitud de la seal de salida, y por tanto la sensibilidad, es directamente proporcional a la potencia de la fuente P0. Normalmente se utiliza una lmpara de arco de xenn o de mercurio.

 Filtros y monocromadores: En los fluormetros se utilizan tanto los filtros de interferencia como los de absorcin, mientras que los espectrofluormetros estn equipados con monocromadores de red. Detectores: La seal de fluorescencia tpica es de baja intensidad, por tanto, se necesitan factores de amplificacin altos para estas medidas. Los tubos fotomultiplicadores son los ms utilizados como detectores en instrumentos de fluorescencia sensibles. Cubetas: Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilndricas como rectangulares fabricadas con vidrio o ms normalmente con slice.

Calibracin
Debido a variaciones de la intensidad de la fuente, de la sensibilidad del detector y de otras variables instrumentales, es muy difcil obtener con un equipo ya sea fluorometro o espectrofluorometro las mismas lecturas por lo cual es una prctica habitual calibrar el instrumento para lo cual se utilizan soluciones patrn constituidas por un compuesto estable llamado fluorforo el cual se caracteriza por tener longitudes de onda conocidas uno de los ms comunes es el sulfato de quinina que en concentracin de 10-5M se excita a 350 nm y fluorece a 450 nm.

APLICACIONES DE LOS MTODOS DE FLUORESCENCIA

La flurometra se utiliza para anlisis cualitativos y cuantitativos de compuestos: Inorgnicos.- Se analizan cationes en forma de quelatos fluorescente para lo que se utilizan reactivos fluorimtricos como: 8 hidroxiquinolina, Flavanol, Benzona, etc. Para aniones se determina el descenso de la fluorescencia por accin amortiguadora del anin que se va ha analizar Orgnicos.- Se utiliza en el anlisis de alimentos, medicamentos, muestras clnicas y productos naturales donde se determinan enzimas, esteroides, vitaminas,agentes medicinales, etc.

Quimioluminiscencia
Concepto.- Mtodo que se basa en que el espectro de emisin de una especie excitada se forma en elcurso de una reaccin qumica. En algunos casos las partculas excitadas son los productos de una reaccin entre el analito y un oxidante fuerte como el ozono o el peroxido de hidrogeno. Cuando este proceso se realiza en sistemas biolgicos se conoce como bioluminiscencia. Ejemplo: La luciernaga, ciertas algas, medusas, etc.