Secuenciacin

Dr. Jessica Noemi Mundo Ayala

Desarrollo histrico
Secuenciacin de cidos nucleicos. Inicialmente, se pensaba que la secuenciacin de los cidos nucleicos era mucho ms difcil que la de las protenas, y muy poco progreso se hizo hasta 1960. Por otro lado, el hecho de tener cuatro componentes solamente, se pensaba, hara ms fciles los analices finales. Hoy, la secuenciacin de cidos nucleicos es ms rpida y simple que la secuenciacin de protenas.

Desarrollo histrico
En 1977, se reportaron dos protocolos para la secuenciacin de ADN. El primer mtodo fue el de Maxam y Gilbert. Con este mtodo, al igual que con el de Sanger, se obtiene una autoradiografa en donde puede leerse una secuencia. Se determina la secuencia de una molcula de ADN utilizando qumicos que cortan en posiciones especficas fragmentos marcados en sus extremos 5.

Desarrollo histrico
El segundo mtodo es el de Sanger. ste utiliza un templado de ADN de cadena sencilla para sintetizar la hebra complementaria, la cual se termina en posiciones especficas. En los dos casos, la secuencia de la molcula se determina por diferencias en los tamaos de los fragmentos generados.

 Los dos protocolos clsicos de secuenciacin (mtodo qumico y enzimtico) comparten etapas comunes. Marcado: Es necesario marcar las molculas a secuenciar radiactiva o fluorescentemente Separacin: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN marcadas cuyos tamaos se diferencian en una nica base. Estas cadenas pueden separarse por electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen como una escalera de bandas cuya longitud vara en un nico nucletido.

El mtodo de degradacin qumica (Maxam y Gilbert, 1977)

En este mtodo, un fragmento de ADN de cadena doble o sencilla se marca en los extremos 5 o 3 de una o ambas hebras con 32P. Despus, la muestra de ADN se divide en cuatro alcuotas y se fragmenta en cuatro reacciones qumicas distintas. Posteriormente, los fragmentos de ADN generados pueden ser separados por electroforesis en cuatro carriles distintos con base en su tamao. Conociendo el nucletido en el que se realizaron los cortes, se puede inferir la secuencia de la molcula original.

Ventajas y desventajas del mtodo de degradacin qumica.

La baja resolucin obtenida no se debi a un factor inherente al mtodo, si no a una limitante de los geles de acrilamida. Permite la lectura de unas 100 bases de secuencia. No separacin de fragmentos grandes. La resolucin de las bandas obtenidas en el gel:
El ensanchamiento de bandas cuyas secuencias favorecen la formacin de estructuras secundarias.

Gel de acrilamida muy delgados, en conjunto con un voltaje alto de corrimiento, produce bandas ms delgadas y mejor separadas. (Sanger
y Coulson, 1978).

Ventajas y desventajas del mtodo de degradacin qumica.

La baja resolucin obtenida no se debi a un factor inherente al mtodo, si no a una limitante de los geles de acrilamida. Permite la lectura de unas 100 bases de secuencia. No separacin de fragmentos grandes. La resolucin de las bandas obtenidas en el gel:
El ensanchamiento de bandas cuyas secuencias favorecen la formacin de estructuras secundarias.

Gel de acrilamida muy delgados, en conjunto con un voltaje alto de corrimiento, produce bandas ms delgadas y mejor separadas. (Sanger
y Coulson, 1978).

El mtodo enzimtico (Sanger et al., 1977)

Sali casi al mismo tiempo que el de Maxam y Gilbert, pero ha sido ms utilizado. El mtodo de Sanger se basa en el uso de la ADN polimerasa para sintetizar cadenas de ADN con una terminacin especfica. Con este mtodo se generan fragmentos de ADN de todos los tamaos posibles que se puedan distinguir entre s, por el tipo de marcaje.

El mtodo enzimtico (Sanger et al., 1977)

Entre los componentes de la reaccin se incluyen nucletidos que no tienen un grupo hidroxilo en su extremo 3 (ddNTP), para poder obtener una terminacin especifica en las cadenas.

Una vez que el ddNTP se incorpora como el residuo terminal, evita que la cadena de ADN sintetizada contine extendindose. La incorporacin de los ddNTPs es al azar, de tal forma que se obtienen fragmentos de todos los tamaos posibles que terminan en un residuo especifico.

Figura 6. El mtodo de Sanger. Cuatro reacciones con ddNTPs diferentes permiten la sntesis de distintos fragmentos con una terminacin especfica. Estos fragmentos se pueden separar por electroforesis y comparando los tamaos, se puede determinar la secuencia del templado.

Ventaja sobre el mtodo de Maxam-Gilbert.

Las reacciones de secuenciacin del mtodo enzimtico se pueden realizar en unas horas, en cambio las del mtodo de Maxam-Gilbert tardan al menos un da. Las reacciones del mtodo de Sanger son ms puras , con menos contaminantes que puedan afectar la resolucin del gel.

Breve descripcin del mtodo automtico de secuenciacin

La principal diferencia entre mtodo enzimtico de terminacin de cadena y el mtodo automtico de secuenciacin radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el mtodo automtico en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reaccin, cada una con nucletido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva sntesis producto de las cuatro mezclas de reaccin.

Breve descripcin del mtodo automtico de secuenciacin

La segunda diferencia radica en el sistema de deteccin de los fragmentos de ADN. La deteccin del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reaccin se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis. Los fragmentos de ADN de menor tamao que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, as, este sistema aumenta el nmero de nucletidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciacin. http://www.youtube.com/watch?v=ujhxO6dPsX0

 Ejemplo de una secuencia obtenida por el mtodo automtico de secuenciacin. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucletido existente en esa posicin de la secuencia.

http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia3a.htm

Microarreglos

Definicin
Diseada por Brown P.O. y Botstein D. en 1999. Un conjunto ordenado de genes en una pequea superficie (10,000 muestras por cm2). Los microarreglos de DNA son una nueva herramienta de la biologa molecular y las ciencias genmicas. La mayora de los investigadores interesados en observar cambios en los niveles de expresin gnica, tenan que estudiar gen por gen. Es posible hacer preguntas a todos los genes de un organismo determinado, en un solo experimento.

Microarreglos de ADN

En los ltimos aos de la dcada de 1990, en los laboratorios de la Universidad de Stanford y de otras universidades de los Estados Unidos, se desarroll un ingenioso mtodo que permite observar el grado de funcionamiento (transcripcin), ya no de un solo gen, sino de un conjunto de miles de genes e incluso de todo un genoma.

 El mtodo de los microarreglos , conocidos tambin como pastillas de ADN (DNA chips) Consiste en depositar microgotas minsculas en las microcuadrculas de un casillero virtual de varios miles de espacios sobre el vidrio de un portaobjetos especialmente preparado.

Microarreglos de ADN

La base de toda la tcnica de los microarreglos est en la hibridacin especfica de segmentos de cidos nucleicos desconocidos con los segmentos (diana o blanco) pegados al vidrio. La especificidad de esta hibridacin est dada por la complementariedad de las secuencias desconocidas con las secuencias diana pegadas al vidrio. El grado de exactitud de la complementariedad del segmento desconocido con el segmento diana es fundamental.

Microarreglos de ADN

Una vez ocurrida la hibridacin se ilumina con luz lser el microarreglo para determinar la presencia o la ausencia y el grado de hibridacin de cada uno de los miles de segmentos diana. Como todos los segmentos desconocidos estaban rotulados con fluorescencia, el nivel de fluorescencia en cada punto es proporcional al nivel de hibridacin.

Microarreglos de ADN

Cada uno de los miles de cuadritos ( o crculos) de un microarreglo corresponde a una reaccin diferente de hibridacin. Lo fundamental en los microarreglos es que se realizan todas las hibridaciones simultneamente y se analizan como un sistema, es decir que se puede visualizar todo el genoma funcionante, o sea la expresin no ya de un gen sino del genoma.

Microarreglos de ADN

Como cada tipo celular expresa solo una parte del genoma, en los microarreglos hay dos conjuntos diferentes de hibridantes: Mientras que los segmentos diana representan la totalidad del genoma, los segmentos desconocidos deben provenir de un solo tejido o tipo celular para poder ser correctamente interpretados. Hepatocitos Queratinocitos Adipocitos

Microarreglos de ADN
Tambin pueden utilizarse las bibliotecas de cDNA de un rgano, que aunque contiene varios tejidos, acta como una unidad funcional. Rin, Pncreas, Cerebro.

Las hibridaciones deben interpretarse como un conjunto de expresiones gnicas de ese rgano.

Microarreglos de ADN
Por consiguiente los microarreglos permiten la definicin de un perfil de expresin gnica de un tejido Determinar ese perfil de expresin gnica para conocer el estado funcional de dicho tejido. No obstante si existen variaciones por las mismas condiciones del ambiente, los perfiles pueden variar. Razn principal para realizar comparaciones. Comparar el conjunto de hibridaciones de un tejido control con el de un tejido experimental

Esquema general del uso de microarreglos.

1. Preparacin de dos muestras de tejido u rgano, idnticas salvo por una variable: una muestra es la muestra control y la otra es experimental
Normal y tumoral Normal y tratada con una droga

2. Extraccin del mRNA total de ambas muestras

se es el universo de expresin gnica de ese tejido en las muestras.

3. Obtencin del cDNA de las dos muestras (RT) en presencia de nt marcados con distintos fluoroforos en cada muestra = distinguir.

Esquema general del uso de microarreglos.

4. Reaccin de hibridacin sobre un portaobjeto con un microarreglo de todo el genoma. Se baa el portaobjeto con el microarrelgo, con una mezcla de partes equivalentes de los dos grupos de cDNA. 5. Examen del microarreglo y deteccin de los tipos de fluorescencia mediante un escner especial que en cada punto del microarreglo anota las coordenadas (del lugar exacto), el tipo de fluorescencia y su intensidad.

Esquema general del uso de microarreglos.

6. Anlisis de los datos; determinacin de los agrupamientos de genes ( clusters ) que se comportan como si estuvieran coordinados (genes cuya transcripcin aumenta o disminuye en forma sincrnica y armnica) 7. Interpretacin de los datos: comparacin con otros ensayos de microarreglos y con bases de datos.

Caracterstica importante de los microarreglos

Al fabricar el microarreglo: cada punto de la cuadrcula donde se deposita una microgota de DNA diana, tiene una direccin precisa (una ordenada y una abscisa para cada punto) El DNA diana que est pegado al vidrio en ese punto puede ser identificado por su posicin.
Ordenada 50 y abscisa 33 de un microarreglo de 100 x 100 (10,000) En esta posicin puede estar el cDNA del gen del canal de cloro de la fibrosis qustica CFTR En el siguiente cuadrado el cDNA de otro gen.

Caracterstica importante de los microarreglos

Como los microarreglos siempres se colocan con microinyectores robticos, siempre se conserva en un archivo de computadora la posicin de cada punto del microarreglo con la identidad del DNA depositado.

Tipos de microarreglos: de cDNA y de oligonucletidos sintticos. Implicancias de sus usos.

Hay dos tipos principales de microarreglos de cidos nucleicos Microarreglos de cDNA Microarreglos de oligonucletidos sintticos Cada tipo de microarreglo tiene sus ventajas y sus caractersticas particulares. Los de cDNA se usan bsicamente para determinar perfiles de expresin gnica de los tejidos. Los microarreglos de oligonucletidos sintticos se utilizan fundamentalmente para la deteccin de SNP o mutaciones de genes determinados.

Tipos de microarreglos: de cDNA y de oligonucletidos sintticos. Implicancias de sus usos.

Los microarreglos de cDNA Tambin llamados impresos por su fabricacin con inyectores similares a los de chorro de tinta de las impresoras Se utilizan en forma creciente en genmica funcional para estudiar las relaciones funcionales de muchos genes entre s.

Para estudiar
Tejidos tumorales versus el tejido normal, La interaccin entre agente patgeno microbiano y husped Efecto de distintas drogas (tejido tratado versus no tratado) Efecto del envejecimiento (joven vs. envejecido)

Tipos de microarreglos: de cDNA y de oligonucletidos sintticos. Implicancias de sus usos.

El uso de los microarreglos de ambos tipos ha apoyado la hiptesis que postula que muchos genes actan en forma de redes . En qu clulas En qu condiciones En qu cantidades debe ser producido el producto gnico. La interpretacin de los resultados no es sencilla sino que requiere mtodos estadsticos especiales, formacin de bases de datos especficas y estandarizacin adecuada de los procedimientos.