Introduo aos Mtodos Cromatogrficos

ANLISE INSTRUMENTAL Prof. Bruno Cortez 1 semestre - 2008

DEFINIO


Conjunto de tcnicas de separao cujo princpio depende da distribuio diferenciada dos componentes de uma mistura entre duas fases, uma considerada estacionria, e a outra, mvel.
KROMA
(COR)

GRAPH
(ESCREVER)

DEFINIO


Diferenas nas propriedades das fases mvel e estacionria possibilitam com que os componentes da amostra se desloquem atravs do material cromatogrfico com velocidades desiguais, gerando a separao

ANLISE CROMATOGRFICA


AFINIDADE SEPARAO

PRINCIPAIS FATOS HISTRICOS

Separao de pigmentos; proposio do termo Cromatografia em cromatografia papel Mikhail Tswett 1903-1906 Izmailov e Shraiber 1938 Primeira publicao em fase gasosa Martin e Synge 1952

1897-1903 David Talbot Day Separao de HC do petrleo

1930

1941

1958 Egon Stahl Cromatografia em camada delgada

Kuhn e Lederer Martin e Synge Cromatografia em coluna Particio em cromatografia lquida; Princpios de fase gasosa

CROMATOGRAFIA

PLANAR

COLUNA

LQUIDA Lquida (CP) Slida (CCD) Lquida (CGL) Slida (CGS)

GS

FLUDO SUPERCRTICO

LQUIDA

Slido (CSS) Ligada (CSFL) Lquida (CLL) Slida (CLS, CE) Ligada (CFLF, CTI e CB)

Ligada (CCD) Ligada (CGFL)

TIPOS DE CROMATOGRAFIA
SIGLA CP CCD CCD-FL CGL CGS CGFL CSS CSFL CLL CLS CE CLFL CTI CB Papel Camada Delgada Camada Delgada com Fase Quimicamente Ligada Gs-Lquido Gs-Slido Gasosa com Fase Quimicamente Ligada Slida com Fase Mvel Super-crtica CSS com Fase Quimicamente Ligada Lquido-Lquido Lquido-Slido Excluso Lquida com Fase Quimicamente Ligada Troca Inica Bioafinidade NOME TIPO DE SEPARAO Partilha Partilha Partilha e Adsoro Distribuio Adsoro Adsoro Adsoro Adsoro Partilha Adsoro Permeao Partilha e Adsoro Interaes Polares Bioatividade

TIPOS DE SEPARAO


Os princpios fsico-qumico bsicos de separao so:

Adsoro: O soluto retido pela superfcie da fase estacionria atravs de interaes qumicas ou fsicas. Partio: O soluto se dissolve na parte lquida que envolve a superfcie do suporte slido. Troca inica: O on da amostra se liga carga fixa (grupo funcional) da fase estacionria. Excluso molculas: As molculas so separadas por tamanho, havendo reteno das maiores. Bioafinidade: Ocorre uma ligao molecular especfica e reversvel entre o soluto e o ligante fixado fase estacionria.

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA PLANAR

CROMATOGRAFIA CIRCULAR

ANLISE CROMATOGRFICA


Separao em colunas convencionais

Considere a aplicao de uma mistura de compostos orgnicos no topo de uma coluna cromatogrfica

ANLISE CROMATOGRFICA


Separao em colunas convencionais

Estabelecida a percolao da FE com o eluente (FM), os componentes da mistura passaro a migrar com velocidades desiguais caso o sistema seja adequado para a separao

ANLISE CROMATOGRFICA



Separao em colunas convencionais

Uma boa seletividade cromatogrfica garantir uma boa separao entre os componentes da amostra

ANLISE CROMATOGRFICA


Separao em colunas convencionais

Cada componente da amostra poder ser coletado isoladamente, atravs de um coletor de fraes (neste caso, um simples frasco coletor)

ANLISE CROMATOGRFICA



Separao em coluna
O monitoramento do eluato da coluna pode ser feito atravs de um detector, cujo sinal identifica a sada de cada componente da mistura, isoladamente

ANLISE CROMATOGRFICA



Separao em coluna
A resposta do detector traduzida em um grfico, ou CROMATOGRAMA, que relaciona o seu sinal com o tempo necessrio para a eluio de cada componente.

ANLISE CROMATOGRFICA



Separao em coluna
As molculas de cada componente tambm migram com velocidades desiguais devido a fenmenos de difuso e transferncia de massa

ANLISE CROMATOGRFICA


Eluio tpica em cromatografia lquida

DEFINIO DE TERMOS



Tempo de reteno
O tempo gasto desde o ato de injeo at a sada do ponto mximo do pico do sistema O tempo de reteno engloba todo o tempo que o componente em questo fica no sistema cromatogrfico, quer na fase mvel quer na fase estacionria

DEFINIO DE TERMOS



Tempo de reteno corrigido

Quando as molculas do soluto ficam na fase mvel, elas devem movimentar-se com a mesma velocidade das molculas da prpria fase mvel. Parte do tempo em que as molculas do soluto esto na fase mvel igual ao tempo gasto para as molculas da fase mvel percorrerem a coluna, tm SENDO ASSIM, PARTE DO TEMPO EM QUE AS MOLCULAS DO SOLUTO FICAM RETIDAS NA FASE ESTACIONRIA CALCULADA PELA DIFERENA

DEFINIO DE TERMOS



Seletividade
Para a cromatografia em coluna, o fator de separao (SELETIVIDADE) calculado pela razo entre os respectivos fatores de reteno que, por sua vez, so relacionados aos tempos de reteno corrigidos

DEFINIO DE TERMOS


Seletividade

DEFINIO DE TERMOS


Capacidade

MTODOS CROMATOGRFICOS


TEORIAS
Martin e Synge Biochem. J. 35, 1358 (1941)


Meio descontnuo anlogo s colunas de destilao fracionada, constitudo por um grande nmero de estgios de equilbrio ou PRATOS TERICOS (TEORIA DOS PRATOS TERICOS)

Van Deemerter, Zuiderweg e Klinkenberg Chem. Eng. Sci. 5, 271 (1956)



Meio contnuo atravs do qual a separao ocorre por fenmenos de difuso e transporte de massa (TEORIA DA VELOCIDADE)

TEORIA DOS PRATOS TERICOS



Nmero de pratos tericos

Coluna cromatogrfica definida como uma srie de estgios independentes onde acontece um quase-equilbrio entre o analito dissolvido na fase estacionria (FE) e o gs de arraste

TEORIA DOS PRATOS TERICOS



Nmero de pratos tericos

O coeficiente Kc determina a distribuio da amostra (A) entre as fases mvel (M) e estacionria (S) em um determinado estgio do equilbrio, obviamente hipottico. Quanto mais efetiva for a presena de A na fase mvel (M) menor ser o seu tempo de reteno

TEORIA DOS PRATOS TERICOS



Nmero de pratos tericos

TEORIA DOS PRATOS TERICOS



Nmero de pratos tericos

TEORIA DOS PRATOS TERICOS



Clculo do nmero de pratos tericos

TEORIA DOS PRATOS TERICOS



Altura equivalente um prato terico

DEFINIO DE TERMOS

RESOLUO CROMATOGRFICA


Equao geral

RESOLUO CROMATOGRFICA


Otimizao de Separaes

DETECTORES


Definies Gerais
Dispositivos que geram um sinal eltrico proporcional quantidade eluda de um analito
  

~60 detectores j usados em CG ~15 equipam cromatgrafos comerciais 4 respondem pela maior parte das aplicaes
Detector por Condutividade Trmica DCT Detector por Ionizao em Chama DIC Detector por Captura de Eltrons DCE Detector Espectromtrico de Massas EM

DETECTORES


Parmetros Bsicos de Desempenho

Quantidade Mnima Detectvel


Massa de um analito que gera um pico com altura igual a trs vezes o nvel de rudo

DETECTORES


Parmetros Bsicos de Desempenho

Limite de Deteco


Quantidade de analito que gera um pico com S/N=3 e wb=1 unidade de tempo

DETECTORES


Parmetros Bsicos de Desempenho

Velocidade de Resposta


Tempo decorrido entre a entrada do analito na cela do detector e a gerao do sinal eltrico

DETECTORES


Parmetros Bsicos de Desempenho

Sensibilidade


Relao entre o incremento de rea do pico e o incremento de massa do analito.

DETECTORES


Parmetros Bsicos de Desempenho

Faixa Linear Dinmica


Intervalo de massas dentro do qual a resposta do detector linear

DETECTORES


CLASSIFICAO

DETECTORES


DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA

Princpio: Variao na condutividade trmica do gs quando da eluio de um analito

DETECTORES


DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA

SELETIVIDADE SENSIBILIDADE/ LINEARIDADE

VAZO DO GS DE ARRASTE

DETECTORES


DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA

Configurao tradicional do DCT: bloco metlico com quatro celas interligadas em par por duas passa o efluente da coluna e por duas, o gs de arraste puro

DETECTORES


DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA

Quando da eluio de um composto com condutividade trmica menor que a do gs de arraste puro:

DETECTORES


DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA

Os filamentos do DCT so montados numa ponte de Wheatstone que transforma a diferena de resistncia quando da eluio de amostra numa diferena de voltagem:

DETECTORES


CARACTERSTICAS OPERACIONAIS DO DCT

SELETIVIDADE: Observa-se sinal para qualquer substncia eluda diferente do gs de arraste = UNIVERSAL SENSIBILIDADE/LINEARIDADE: Dependendo da configurao particular e do analito: QMD=0,4 ng a 1 ng com linearidade de 104 (ng = dezenas de Qg) VAZO DO GS DE ARRASTE: O sinal proporcional concentrao do analito no gs de arraste que passa pela cela de amostra

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DCT

Natureza do Gs de Arraste: Quanto maior a diferena de P entre a condutividade trmica do gs de arraste puro, PA, e do analito PX, MAIOR A RESPOSTA. P = PA - PX Como P 1/M (M=massa molecular) QUANTO MENOR A MASSA MOLECULAR DO GS DE ARRASTE, MAIOR A RESPOSTA

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DCT

FATORES DE RESPOSTA: Quanto menor a condutividade trmica do analito, maior o sinal


Os fatores de resposta dependem da condutividade trmica do analito

Quantidades iguais de substncias diferentes geram picos cromatogrficos com reas diferentes!!!

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DCT

TEMPERATURAS DE OPERAO: Quanto maior a diferena entre a temperatura dos filamentos e do bloco metlico maior a resposta.

DETECTORES


APLICAES
Separao e quantificao de compostos que no geram sinal em outros detectores (gases nobres, gases fixos) Por ser um detector NO-DESTRUTIVO, pode ser usado em CG preparativa ou deteco seqencial com dois detectores em tandem.

DETECTORES
CONDUTIVIDADE TRMICA DE ALGUNS GASES

DETECTORES


DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA

PRINCPIO: Formao de ons quando um composto queimado em uma chama de hidrognio e oxignio.

DETECTORES


DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA

DETECTORES


DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA

Regio de quebra: Mistura dos gases, praquecimento, incio da quebra das molculas de H2, O2 e outros analitos Zona de reao: Reaes exotrmicas com produo e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2 (provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do analito) e ons CHO+ (analito) Zona de incandescncia: Emisso de luz por decaimento de espcies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visvel)

DETECTORES


DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DIC

SELETIVIDADE: Seletivo para substncias que contm ligaes C-H em sua estrutura qumica


Como virtualmente todas as substncias analisveis por CG so orgnicas, na PRTICA o DIC UNIVERSAL)

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DIC

SENSIBILIDADE/LINEARIDADE: QMD tpicas = 10 pg a 100 pg com linearidade entre 107 e 108 (pg a mg) VAZES DE GASES: Alm do gs de arraste, as vazes de alimentao de ar (comburente) e hidrognio (combustvel) devem ser otimizadas.

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DIC

TEMPERATURA DE OPERAO: O efeito da temperatura sobre o sinal do DIC negligencivel. TRATAMENTO DO SINAL: Por causa da baixa magnitude da corrente eltrica gerada (pA a nA), ela deve ser amplificada para poder ser registrada.

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DIC

FATORES DE RESPOSTA: O fator de resposta de um determinado composto aproximadamente proporcional ao nmero de tomos de carbono. Presena de heteroelementos diminui o fator de resposta.

DETECTORES


DETECTOR DE NITROGNIOFSFORO
Modificao do DIC altamente seletiva para compostos orgnicos nitrogenados e fosforados

DETECTORES


DETECTORES POR CAPTURA DE ELTRONS

PRINCPIO: Supresso de um fluxo de eltrons lentos (termais) causada pela sua absoro por espcies eletroflicas

DETECTORES


DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS

MECANISMO DE CAPTURA DE ELTRONS

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DCE

FONTE RADIOATIVA: O nodo deve estar dopado com um istopo radioativo ou emissor

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DCE

Polarizao dos eletrodos: Vrios modos de polarizao possveis
 

VOLTAGEM CONSTANTE: Pouco usada modernamente picos cromatogrficos podem ser deformados VOLTAGEM PULSADA: Menos anomalias eltricas maior sensibilidade e linearidade Variao de 3 C na temperatura Erro ~10% na rea dos picos Magnitude e sinal do erro depende do composto analisado! TEMPERATURA DO DCE DEVE SER RIGOROSAMENTE CONTROLADA

Temperatura do detector: Dependncia do sinal com temperatura de operao bastante significativa

  

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DCE

GS DE ARRASTE: Funcionamento do DCE muito dependente da natureza do gs de arraste

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DCE

SENSIBILIDADE/LINEARIDADE:


QMD=0,01 pg a 1 pg (organoclorados), linearidade ~104 (pg a ng)

DETECTORES


Caractersticas Operacionais do DCE

SELETIVIDADE/FATORES DE RESPOSTA


Valores de S maximizados para compostos eletroflicos

DETECTORES


Detector de Captura de Eltrons

APLICAO

DETECTORES

CROMATOGRAFIA GASOSA
Compostos volteis de pontos de ebulio de at 350 C e pesos moleculares menores que 500  Compostos que possam produzir derivados volteis  Compostos termicamente estveis na condies de trabalho


CROMATOGRAFIA GASOSA


ALGUMAS APLICAES
Indstria Petroqumica Alimentos e Bebidas Biocidas Medicamentos Meio ambiente

CROMATOGRAFIA GASOSA

CROMATOGRAFIA GASOSA


GS DE ARRASTE
FASE MVEL EM CG: NO interage com a amostra apenas a carrega atravs da coluna. Assim usualmente referida como gs de arraste

INERTE: No deve reagir com a amostra, fase estacionria ou superfcies do instrumento PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionria

CROMATOGRAFIA GASOSA


Impurezas tpicas em gases e seus efeitos:

H2O, O2
oxida/hidrolisa algumas FE, incompatveis com DCE

Hidrocarbonetos
rudo no sinal de DIC

CROMATOGRAFIA GASOSA
GASES - FILTROS

CROMATOGRAFIA GASOSA


CUSTO: Gases de altssima pureza podem ser muito caros

CROMATOGRAFIA GASOSA


COMPATVEL COM UM DETECTOR:

Cada detector demanda um gs de arraste especfico para melhor funcionamento

CROMATOGRAFIA GASOSA


Alimentao do gs de arraste

CROMATOGRAFIA GASOSA


Dispositivos de Injeo de Amostra

Os dispositivos para injeo (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introduo INSTANTNEA da amostra na coluna cromatogrfica

CROMATOGRAFIA GASOSA


SISTEMAS DE INJEO

CROMATOGRAFIA GASOSA
INJETOR ON-COLUMN CONVENCIONAL

CROMATOGRAFIA GASOSA


Injeo on-column de lquidos

CROMATOGRAFIA GASOSA


INJETORES SPLIT/SPLITLESS

CROMATOGRAFIA GASOSA


SPLIT
Amostras concentradas onde a diluio com solvente impossvel particularmente devido a co-eluio

SPLITLESS
Amostras diludas ou anlise de traos Anlise em ampla faixa de ponto de ebulio e polaridade Adequado para anlide de amostras complexas (multicomponentes)

CROMATOGRAFIA GASOSA


Parmetros de Injeo
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposio


REGRA GERAL: Tinj=50 C acima da temperatura de ebulio do componente menos voltil

VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado fsico da amostra

Slidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a soluo

CROMATOGRAFIA GASOSA


MICROSSERINGAS PARA INJEO

LQUIDOS: capacidades tpicas 10 L 1 L, 5 L e

CROMATOGRAFIA GASOSA


COLUNAS CROMATOGRFICAS

Colunas empacotadas

CROMATOGRAFIA GASOSA

CROMATOGRAFIA GASOSA


COLUNAS CROMATOGRFICAS
Coluna Empacotada  VANTAGENS
Simples preparao e uso Tecnologia clssica Grande nmero de fases lquidas Capacidade alta e longa durabilidade Usada para anlise de gases com DCT


DESVANTAGENS
Nmero de pratos limitado Exige controle da vazo da fase mvel Anlises relativamente demoradas Baixa resoluo para amostras complexas

CROMATOGRAFIA GASOSA


Temperatura da Coluna
Alm da interao da FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSO DE VAPOR (p0)

CROMATOGRAFIA GASOSA


Temperatura da Coluna
CONTROLE CONFIVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAO EM CG

CROMATOGRAFIA GASOSA


FORNO DA COLUNA
Caractersticas desejveis de um forno:  Ampla faixa de temperatura de uso: Pelo menos de Tamb at 400 C. Sistemas criognicos (T < Tamb) podem ser necessrios em casos especiais  Temperatura independente dos demais mdulos: No deve ser afetado pela temperatura do injetor e detector  Temperatura uniforme em seu interior: Sistemas de ventilao interna muito eficientes para manter a temperatura homognea em todo forno

CROMATOGRAFIA GASOSA


FORNO DA COLUNA
Caractersticas desejveis de um forno:  Fcil acesso coluna: A operao de troca de coluna pode ser freqente  Aquecimento e resfriamento rpido: Importante tanto em anlises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analticas novas  Temperatura estvel e reprodutvel: A temperatura deve ser mantida com preciso e exatido de 0,1 C
EM CROMATGRAFOS MODERNOS (DEPOIS DE 1980) O CONTROLE DE TEMPERATURA DO FORNO TOTALMENTE OPERADO POR MICROCOMPUTADORES

CROMATOGRAFIA GASOSA


Programao Linear de Temperatura

Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

CROMATOGRAFIA GASOSA


Programao Linear de Temperatura

A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separao:

CROMATOGRAFIA GASOSA


Programao Linear de Temperatura

POSSVEIS PROBLEMAS ASSOCIADOS PLT

CROMATOGRAFIA GASOSA


DETECTORES: Dispositivos que

examinam continuamente o material eludo, gerando sinal quando da passagem de substncias que no o gs de arraste

CROMATOGRAFIA GASOSA


DETECTORES MAIS IMPORTANTES:

Detector por condutividade trmica (DCT ou TCD): Variao da condutividade trmica do gs de arraste Detector por Ionizao de Chama (DIC ou FID): ons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar Detector por Captura de Eltrons (DCE ou ECD): Supresso de corrente causada pela absoro de eltrons por eluatos altamente eletroflicos

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS

CROMATOGRAFIA GASOSA


Caractersticas de uma FE ideal

SELETIVA: Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra

REGRA GERAL: A FE deve ter caractersticas tanto quanto possvel prximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromtico...)

CROMATOGRAFIA GASOSA


Caractersticas de uma FE ideal

AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO: Maior flexibilidade na otimizao da separao BOA ESTABILIDADE QUMICA E TRMICA: Maior durabilidade da coluna, no reage com componentes da amostra POUCA VISCOSIDADE: Colunas mais eficientes (menor resistncia transferncia do analito entre fases) DISPONVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA: Colunas reprodutveis; ausncia de picos fantasma nos cromatogramas

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS SLIDAS: ADSORO

O fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao do analito + FE slida a ADSORO

A adsoro ocorre na interface entre o gs de arraste e a FE slida

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS SLIDAS: ADSORO

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS SLIDAS

Caractersticas Gerais:
Slidos finamente granulados (dimetros de partculas tpicos de 105 Qm a 420 Qm)  Grandes reas superficiais (at 102 m2/g)


CROMATOGRAFIA GASOSA

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS LQUIDAS: ABSORO

O fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao do analito + FE slida a ABSORO

A ABSORO OCORRE NO INTERIOR DO FILME DE FE LQUIDA (FENMENO INTRAFACIAL)

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS LQUIDAS: ABSORO

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS
FAMLIAS DE FE LQUIDAS

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS
FAMLIAS DE FE LQUIDAS

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS
FAMLIAS DE FE LQUIDAS

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS
QUIRAIS

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS
QUIRAIS

CROMATOGRAFIA GASOSA


FASES ESTACIONRIAS
QUIRAIS

CROMATOGRAFIA GASOSA

CROMATOGRAFIA GASOSA


COLUNAS EMPACOTADAS
Tubo de material inerte recheado com FE slida granulada ou FE lquida depositada sobre um suporte slido

CROMATOGRAFIA GASOSA


COLUNAS EMPACOTADAS
FE Lquidas: SUPORTE

CROMATOGRAFIA GASOSA


COLUNAS CAPILARES

CROMATOGRAFIA GASOSA


COLUNAS CAPILARES
DIMETRO INTERNO

cromatografia