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Universidade Federal do Rio Grande Escola de Qumica e Alimentos Laboratrio de Engenharia de Bioprocessos

Bioqumica Industrial
Captulo IV - Enzimas

Dr. Carlos Andr Veiga Burkert


2011

Parte I
Conceitos Fundamentais

Enzimas - Definio
Todas as enzimas so macromolculas que pertencem classe das protenas globulares; algumas so holoprotenas (protenas simples) constitudas unicamente de um encadeamento de aminocidos; outras so heteroprotenas (protenas conjugadas) que possuem uma parte noprotica, o cofator, em geral necessria atividade cataltica e ligada, mais ou menos fortemente, protena Cada protena constituda por cadeia proteica (estrutura terciria ou quaternria), com seqncia de aminocidos e conseqentes interaes que determinam uma conformao estrutural nica, a qual determina a atividade e especificidade enzimtica

Enzimas O Centro Ativo


A conformao tridimensional da enzima, relacionado sua seqncia de aminocidos, determina a formao de um centro ativo, que pode ser definido como parte (s) da estrutura da enzima que atua em contato direto com o substrato, proporcionando as reaes O centro ativo muito pequeno em relao ao tamanho da enzima, sendo composto por aminocidos no necessariamente adjacentes na seqncia linear Em funo da conformao tridimensional da molcula ficam espacialmente prximos, definindo uma estrutura peculiar, que confere s enzimas propriedades distintas e definidas

Convm ressaltar que o restante da estrutura que torna possvel a existncia desse local na molcula

Enzimas Cofatores
So os constituintes no proteicos, em geral de alguma forma determinantes da atividade cataltica da enzima
Os cofatores so divididos em grupos prostticos e coenzimas. A diferena bsica entre ambos est no fato de que o grupo prosttico est fortemente ligado estrutura da enzima e a coenzima no.

Enzimas Exemplos de Cofatores


Cofator NAD NADP ATP UTP CTP CoA Vitamina Niacina Niacina cido Pantotnico FMN FAD Piridoxal Fosfato Tiamina Pirofosfato Tiamina + Riboflavina Riboflavina Piridoxina + + + + + Adenina Fosfato + + + + + + Ribose + + + + + + Base Adenina Adenina Adenina Uracila Citosina Adenina

NAD: Nicotinaamida Adenina Dinucleotdeo; NADP: Nicotinaamida Adenina Dinucleotdeo Fosfato; ATP: Adenosina Trifosfato; UTP: Uridina Trifosfato: Citidina Trifosfato; FMN: Flavina Mono-Nucleotdeo; FAD: Flavina Adenina Dinucleotdeo

Enzimas ons Inorgnicos


Metal Zn Mn Mo Cu Mg Co Fe Ca Enzima Carboxypeptidase, lcool Desidrogenase Arginase Nitrato Redutase Polifenol Oxidase Piruvato Descarboxilase Glicilglicina Dipeptidase Catalase, Peroxidase -Amilase

Parte II
Mecanismo de Atuao

Mecanismo Chave-Fechadura

Complementaridade espacial entre centro ativo e substrato

Mecanismo Chave-Fechadura
Conseqncias:
Reaes altamente especficas: no h formao de subprodutos Baixa energia de ativao: temperaturas brandas

Mecanismo Chave-Fechadura - Exemplo

Mecanismo esquemtico da enzima invertase

The three-dimensional structure of invertase. (a) The overall threedimensional structure of invertase. Three glycosylation sites could be allocated to invertase on residues Asn116, Asn143 and Asn299 (indicated in red). The glycosylation chains are indicated in orange. The figure was prepared with PyMOL (DeLano, 2002 ). (b) Schematic diagram of the topology of invertase. Strands are depicted by arrows and helices by cylinders. Asterisks represent the glycosylation sites.

Mecanismo Chave-Fechadura - Exemplo

Especificidade Enzimtica
Em funo da conformao da complexa molcula protica, da singularidade de seu stio ativo e da configurao estrutural da molcula do substrato, uma enzima selecionar somente um nmero limitado de compostos Esta especificidade pode ser de grupo, quando grupo de compostos pode servir de substrato, como as quinases que fosforilam aldoexoses. Pode ser de grupo absoluta, quando atua sobre um nico substrato (glicose, por exemplo), ou de grupo relativa (uma srie homloga de aldoexoses). Pode-se ter estereoespecificidade (por um ismero tico D ou L) ou especificidade cis-trans.

Classificao das Enzimas


1. Oxidorredutases: catalisam reaes de oxirreduo, como por exemplo desidrogenaes de substratos e transferncia de eltrons, normalmente relacionados a processos respiratrios e fermentativos
2. Transferases: catalisam a transferncia de grupos funcionais de um composto para outro (metil-, carboxil-, resduos aldedicos, cetnicos, nitrogenados, contendo P e S, etc)

3. Hidrolases: catalisam reaes de hidrlise (ligaes steres, glicosdicas, peptdicas, etc) 4. Liases: catalisam a adio a duplas ligaes 5. Isomerases: catalisam reaes de isomerizao 6. Ligases: formam ligaes, com desdobramento de ATP

Parte III Enzimas na Indstria

Enzimas x Catalisador Qumico


Caracterstica Especificidade Estrutura Sensibilidade ao pH e T Condies de Reao Custo Consumo de Energia Formao de Subprodutos Separao Atividade Cataltica Estabilidade Energia de Ativao Velocidade de Reao Enzima Alta Complexa Alta Suaves Alto Baixo Baixa Difcil Alta Baixa Baixa Alta Catalisador Baixa Simples Baixa Drsticas Baixo Alto Alta Simples Baixa Alta Alta Baixa

Porque Enzimas ?

Alta especificidade Exigncia de condies brandas de reao Baixa formao de subprodutos Alta capacidade cataltica Biodegradveis

Porque Enzimas ?
Forma o produto: -amilase, amiloglicosidase, invertase, b-galactosidase, inulinase, lipase
Conferir uma propriedade a um produto (modifica o produto): b-galactosidase, pectinase Elimina substncias indesejveis em um produto: glicose-oxidase

Fontes de Enzimas
Fontes de enzimas
Animais Vegetais Microrganismos

Parte IV

Cintica Enzimtica

Cintica Enzimtica consideraes iniciais


Entende-se por cintica enzimtica a anlise quantitativa do efeito de cada um dos fatores que influencia a atividade enzimtica avaliada atravs do aumento ou reduo da velocidade da reao catalisada
A atividade da enzima e, portanto, a cintica enzimtica, determinada pela concentrao da enzima, concentrao de cofatores, concentrao e tipo de inibidores (quando presentes) e ainda pH, temperatura e fora inica

Conceito de Atividade Enzimtica


Atividade enzimtica
Expresso da capacidade de catlise da enzima, sendo a unidade particular para cada enzima e o valor vlido para as condies do ensaio

Exemplos
Bacterial Amylase Novo (480-1.000 KNU/g)
1 KNU (Kilo Novo Unit): quantidade de enzima que ir quebrar 5,26 g de amido Merck por hora nas condies do experimento (37oC, pH 5,6, 20 min, 0,0043M Ca)

Alpha Fungal Amylase Amano (40.000 e 100.000 SKB)


SKB (Sandstedt, Kneen and Blish): gramas de amido que, sob influncia de um excesso de b-amilase, so dextrinizados por 1 g de amilase em 1 h a 30oC

Atividade Molecular e Turnover

Number

Atividade Molecular
Nmero de molculas de substrato convertidas por molcula de enzima por minuto

Turnover Number (nmero de transformao,


atividade molar)
Nmero de moles de substrato convertido em produto por mol de enzima por minuto

Enzimas hidrolticas: turnover number de 101 a 102 s-1 (papana = 10 s-1)


Enzimas oxidativas: turnover number de 106 a 107 s-1 (catalase = 107 s-1)

Mecanismos da Reao Enzimtica

Mecanismo chave-fechadura (Emil Fischer, 1894): a enzima possui centro ativo complementar ao substrato

Modelo da Reao Enzimtica

Henri (1903) Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)

Efeito do pH

Efeito do pH grupos prototrpicos


Grupo Carboxila Ionizao COOH = -COO- + H+ pK a (3,0 3,2) b (3,0 4,7) Sulfidrila -SH = -S- + H+ 8,0 8,5

Amina

-NH3+ = NH2 + H+

a (7,6-8,4) (9,4 10,6)

aLocalizado

no final da cadeia polipeptdica

Efeito da Temperatura

Efeito do Binmio Tempo-Temperatura


Valor D: representa o tempo necessrio para reduzir a atividade cataltica a uma atividade residual a 10%

Valor Z: diferena de temperatura requerida para reduzir o valor D de 100% a 10%


Lipoxigenase: 3,6 oC

Polifenoloxidase: 7,8 oC
Peroxidase: 35 oC

Modelo da Reao Enzimtica

Henri e Brown (1903) Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)

Modelo da Reao Enzimtica


E S
Sendo: [Eo] = a concentrao da enzima disponvel no incio da reao; [E] = a concentrao da enzima no ligada ao complexo enzima-substrato [So] = concentrao total do substrato disponvel no incio da reao [So]>>>[Eo]
1 K 1 K

K2 ES E P

Modelo da Reao Enzimtica


dP v o K 2 [ES] dt dES K 1[E][So ] dt dES K 1[ES] K 2 [ES] dt No equilbrio:

dES dES dt dt K 1[E][So ] K 1[ES] K 2 [ES] K 1[E][So ] [K 1 K 2 ][ES]

Modelo da Reao Enzimtica


Sendo:
[E] [E o ] [ES] K 1([Eo ] [ES])[So ] [K 1 K 2 ][ES] [ES] [E o ][So ] K 1 K 2 [S o ] K1

K 2 [E o ][So ] vo K m [S o ]

Na situao da enzima saturada com o substrato tem-se que:


[Eo ] [ES] K 2 [ES] K 2 [Eo ] v max

Modelo de Michaelis-Menten

v max [So ] vo K m So

S0<<Km, v0=KS0 S0>>Km, v0=vmax S0=Km, v0=vmax/2

Clculo de Km e Vmx Diagrama de Lineweaver-Burk

1 Km 1 1 . v 0 vmax [S0 ] vmax