2.

 Modulation of Chromatin Structure

 Chromatin structure is dynamic rather static 
 Practically we can consider modulation of 
chromatin structure at two levels: effects on 
nucleosome and effects on higher order structure

   
 Transcription factor binding to DNA is 
inhibited within nucleosomes

• Chromatin assembly inhibits transcription by all three RNA 
polymerases in vitro.
• In vivo genetic evidence links histones to repression (and activation as 
well).
• Affinity of transcription factor for its binding site on DNA is decreased 
when the DNA is reconstituted into nucleosomes.
• The binding of TBP to the TATA box is very sensitive to chromatin 
assembly in vitro.  
• Extent of inhibition is dependent on:
– Location of the binding site within the nucleosome.
• binding sites at the edge are more accessible than the center
– The type of DNA binding domain. 
• Zn fingers bind more easily than bHLH domains.
   
 Stimulate binding of transcription 
factors to nucleosomes

• Cooperative binding of multiple factors.
• The presence of histone chaperone 
proteins which can compete H2A/H2B 
dimers from the octamer.
• Acetylation of the N­terminal tails of the 
core histones
• Nucleosome disruption by ATP­dependent 
remodeling complexes.
   
 Mechanisms for chromatin remodeling

–Modulation by incorporation of histone variants
–Modulation by ATP­driven chromatin remodeling complexes
–Modulation by enzymes that post­translationally modify 
histones
Acetylation
Methylation
Ubiqitination
Phosphorylation
ADP­ribosylation

   
 There are 
a large 
number of 
Histone 
H2A 
variants. 
The 
function of 
these 
variants 
are just 
begun to 
be 
revealed

   
 Modulation by Histone Variants
• In addition to the major histones H2A, H2B, H3 
and H4, many organisms also have distinct 
batteries of histone variants
– H2AZ and H2AX 
 H2AZ has been shown to associate with actively 
transcribed chromatin regions
 H2AX has been shown to be crucial for chromatin 
decompaction during DNA repair. Phosphorylation on its 
SQE/DØ sequence is one of the earliest events in 
response to double­strand DNA breaks
– H3.3 and CenH3s (CenpA in human)
 H3.3 is a replacement H3 variant
 CenH3s are centromere­specific H3 variants
• Histones H2B and H4 have very few variants
   
 Histone H3 variants 

CenpA is required for the specific structure and 
  function in centromere
 
 Conclusions

The chromatin structure and function can be 
different dependent on the presence or absence of 
histone variants because their differences in amino 
acid sequences and conformations. We are still at 
the very early phase in term of understanding the 
roles of histone variants.

   
 Remodeling by ATP­driven 
chromatin remodeling complexes
• Yeast SWI/SNF
– 10 proteins
– Needed for expression of genes involved in mating­type 
switching and sucrose metabolism (sucrose non­
fermenting).
– Some suppressors of swi or snf mutants are mutations 
in genes encoding histones.
– SWI/SNF complex interacts with chromatin to activate a 
subset of yeast genes.
– Is an ATPase
• Mammalian homologs: hSWI/SNF
– ATPase is BRG1, related to Drosophila Brahma
   
• Other remodeling ATPase have been discovered.
 Partial list of chromatin remodeling 
complexes
Complex Organism Factor
SWI/SNF Yeast swi/snf
RCS Yeast sth1
NRUF Drosophila ISWI
CHRAC Drosophila ISWI
ACF Drosophila ISWI
BRM Drosophila BRM
BRG­1 Mammals BRG
hBRM Mammals BRM
associated
 
complexes  
   
 Chromatin Remodeling Factors

            ATPase
Species               subunit
 Yeast SWI/SNF complex             SWI/SNF2
RSC complex STH1

Drosophila NURF ISWI

CHRAC ISWI
ACF ISWI
BRM complex BRM

Human BRG1 complex BRG1

hbrm complex hbrm

•Remodeling activity is dependent on or associated with ATP hydrolysis.
•NTP binding subunit possesses DNA­stimulated ATPase activity.
•Postulated that the NTP binding subunit acts as a processive, ATP­driven DNA­ 
                       translocating motor that disrupts histone­DNA interactions.   

   
 How do chromatin remodeling 
complexes work? 

• Structural alteration
• Nucleosome sliding
• Nucleosome eviction

The consequence of chromatin remodeling is 
dependent on the type of chromatin 
  remodeling complexes involved
 
 Remodeling by SWI/SNF
SWI/SNF + ATP

Nucleosome

Based on in vitro studies using 
reconstituted nucleosome and 
purified SWI/SNF complexes 

1. Structural alteration 
2. Generation of stable dimers
   
3. Octamer transfer
 Chromatin remodeling ATPases catalyze 
stable alteration of the nucleosome

II: form a stably remodeled dimer, altered DNAse digestion pattern
III: transfer a histone octamer to a different DNA fragment
   
 Involvement of SWI/SNF in transcription
• The SWI/SNF complex is required for transcriptional activation of 5%
yeast genes.
• Can be recruited directly through interaction with DNA binding
transcription factors.
• Can be recruited indirectly by interaction with other transcriptional
coactivators or along with the RNA polymerase holoenzyme.
• Other unidentified chromatin-remodeling activities might be recruited by
pathways as yet undefined.
• SWI/SNF complex exerts its major effect in transcriptional activation at a
step subsequent to transcriptional activator-promoter recognition.
• In the yeast, the SWI/SNF complex has been proposed to antagonize the
repressive effects of chromatin by disrupting nucleosomes.
• Dependent on the chromatin organization as well as the transcription
factors involved, the SWI/SNF also contributes to transcriptional
repression.
   
 Nucleosome sliding induced by ISWI­
containing complexes

NURF +ATP NURF +ATP NURF +ATP

TF
Evenly spaced
nucleosomes
Stable, low energy
state
Allow TF to bind

• Make nucleosome mobile in the presence of ATP
• Also involve in nucleosome/chromatin assembly
•  Have roles in both transcriptional activation and repression
 
 Recent evidence: nucleosome 
eviction as a result of chromatin 
remodeling by SWI/SNF
Yeast Pho5 gene

Induction with low phosphate

Swi4/ Pol II
swi6

• Promoter region is DNase I hypersensitive upon induction
• Promoter region contains less histones after induction
   
 Remodeling by covalent modification 
of histones in chromatin

   
 Multiple modifications and enormous potential 
  combinations
 
 Two types of Histone 
Acetyltransferases (HATs).

• Type A nuclear HATs:  acetylate histones in 
chromatin.
• Type B cytoplasmic HATs: acetylate free 
histones prior to their assembly into 
chromatin.
– Acetylate K5 and K12 in histone H4
 Acetylation by nuclear HATs is associated 
with transcriptional activation
• Highly acetylated histones are associated with actively 
transcribed chromatin
– Increasing histone acetylation can turn on some genes.
– Immunoprecipitation of DNA cross­linked to chromatin with 
antibodies against Ac­histones enriches for actively transcribed 
genes. 
• Acetylation of histone N­terminal tails affects the ability of 
nucleosomes to associate in higher­order structures
– The acetylated chromatin is more “open”
• DNase sensitive
• accessible to transcription factors and polymerases
• HATs are implicated as co­activators of genes in 
chromatin, and HDACs (histone deacetylases) are 
implicated as co­repressors
   
 Nuclear HAT As are coactivators
• Gcn5p is a transcriptional activator of many genes 
in yeast.  It is also a HAT.
• PCAF (P300/CBP associated factor) is a HAT and 
is homologous to yeast Gcn5p.
• P300 and CBP are similar proteins that interact 
with many transcription factors (e.g. CREB, AP1 
and MyoD).
• P300/CBP are needed for activation by these 
factors, and thus are considered coactivators.
• P300/CBP has intrinsic HAT activity as well as 
binding to the HAT PCAF.
   
 Table 1. HAT families and their transcription-related functions
(adapted from Marmorstein and Roth, 2001)
HAT family Members Function
GNAT Gcn5, PCAF, Ada, Coactivator
SAGA Replication dependent
Hat1 chromatin assembly
Elp3, Hpa2

MYST Sas2, Ybf2/Sas3, Esa1 Silencing, Cell cycle

MOF, Tip60 progression
MOZ Dosage compensation
HBO1 Leukemogenesis
Origin recognition interaction

TAFII250 TAFII250 TBP-associated factor

CBP/p300 CBP, p300 Global coactivator

SRC SRC-1, ACTR, SRC-3 Steroid receptor coactivators

TIF-2, GRIP1

ATF-2 ATF-2 Sequence specific DNA

binding activator

TFIIIC TFIIIC RNA pol III initiation

   
 HAT complexes often contain several 
transcription regulatory proteins.
• Example of the SAGA complex components:
• Gcn5: catalytic subunit, histone acetyl transferase
• Ada proteins
– transcription adaptor proteins required for function of 
some activators in yeast.
• Spt proteins (TBP­group)
– regulate function of the TATA­binding protein.
• TAF proteins
– associate with TBP and also regulate its function.
• Tra1
– homologue of a human protein involved in cellular transformation. 
  – May be direct  target of activator proteins.
 
 Roles of histone acetylation
• Increase access of transcription factors to 
DNA in nucleosomes.
• Decondense 30nm chromatin fibers
• Serve as markers for binding of non­histone 
proteins (e.g. bromodomain proteins).

   
 Effect of Histone Acetylation on
Chromatin Structure and Transcription

   
 Histone deacetylation is catalyzed by 
histone deacetylases and associated 
with transcriptional repression
Histone deacetylases (HDACs):
2. Three classes, about 20 identified members.
3. can be recruited by transcriptional repressors to  
 specific target genes and/or deacetylate 
histones in chromatin in a non­targeting, global 
fashion.
4. Acetylation and deacetylation are very dynamic 
events
5. Aberrant histone deacetylation has been linked 
  to cancer  
 Effect of Histone Acetylation on
Chromatin Structure and Transcription

Repression

Activation

   
   
 Information about three classes of 
HDACs
• Class I HDACs are relatively small in size, 
abundant, ubiqitously expressed, mainly nuclear, 
sensitive to TSA and tend to associate 
corepressor proteins to form large corepressor 
complexes.
• Class II HDACs are relatively larger in size, less 
abundant, shuffling between cytoplasm and nuclei, 
likely tissue­specific and sensitive to TSA.
• Class III HDACs are less well known and involved 
in silencing of rRNA genes and telomere silencing 
and not sensitive to TSA.
   
   
HDAC inhibitors can induce cell differentiation 
possibly through induction of p21 and cyclin D1and 
has been tested as cancer treatment drugs in 
clinical trials
   
 Class I HDACs are found in large protein 
complexes

HDAC3 HDAC1/2
TBL1 RbAp46

SMRT/ TBLR1 RbAp48

N­CoR Sin3A
GPS2 SAP18

SMRT/N­CoR complexes                    Sin3A complex

   
 Comparison of Sin3, Mi­2/NURD and 
SMRT/N­CoR class I HDAC complexes
  Sin3   Mi­2/NURD   SMRT/N­CoR
        
  HDAC1/HDAC2   HDAC1/HDAC2   HDAC3 Histone 
  RbAp46   RbAp46   TBL1 deacetylases
WD­40 repeat histone­
  RbAp48   RbAp48   TBLR1     binding proteins
  SAP18   MTA2   GPS2
  SAP30   MBD3   IR10
  Sin3   CHD3/CHD4   SMRT/N­CoR Scaffold 
proteins

  MeCP2   MBD2   Kaiso Methyl CpG binding

protein

   
Repression by deacetylation of histones 
by SIR2

   
 Methylated DNA can recruit HDACs

   
 Histone Methylation

   
 Histone Methylation
• Two types of HMTs: arginine specific­HMTs and lysine­
specific HMTs.
• Histone methylation (mono­, di­ and tri­methylation) is 
known for a long time, but the HMTs responsible for 
histone methylation have only recently been identified.
• In contrast to histone acetylation, histone methylation is 
stable. Turnover rate of histone methylation is similar to 
that of histone turnover.
• The first identified Arg­specific HMT is Carm1/PRMT1. It 
can methylates Arg­2, Arg­17 and Arg­26 in H3. It functions 
as a transcriptional coactivator for nulcear hormone 
receptor.
• The first identified Lys­specific HMT is SUV391, based on 
its similarity to plant protein metyltransferase. The 
enzymatic activity resides in the highly conserved SET 
(Suppressor of variegation, Enhancer of Zeste and 
   
Trithorax) domain.
 Nature (Article) 406, 593­599. Aug. 10, 2000

Regulation of chromatin structure by 
site­specific histone H3 methyltransferases
Stephen Rea, Grank Eisenhaber, Donal O’Carroll, Brian D. Strahl, Zu­Wen Sun, Manfred Schmid,
Susanne Opravil, Karl Mechtler, Chris P. Ponting, C. David Allis & Thomas Jenuwein

1. Human and murine SUV39H1 contains a SET domain  
resembling plant methyltransferase proteins
2. Human and murine SUV39H1 is a H3 K9 Specific HMTase
3.  Mapped the catalytic motif (SET domain plus the adjacent 
cysteine­rich regions)
4.  K9 methylation interferes with S10 phosphorylation
5.   Suv39h1 null cells have heterochromatin defects

   
 Approaches for identification and 
characterization of HMTs

1. Biochemical purification of HMT activities using in vitro 
HMT assay.
2. Sequence similarity: testing the proteins containing a SET 
domain.

   
 Summary of Known HMTases and Their Target Sites

HMTase Histones Sites Roles in transcription

CARM1 H3 R2, R17, R26 Activation and elongation

PRMT1 H4 R3 activation

Suv39H1/Clr4/ESET/ H3 K9 silencing

ySET1/mSET9/mSET7 H3 K4 Silencing and elongation

ySET2 H3 K36 elongation

G9a H3 K9, K27 silencing

EZH1/EZH2 H3     K27 silencing

DOT1 H3 K79 Not clear

SET8 H4 K20 Silencing, cell cycle

   
 Underlining mechanisms
• H4­R3 methylation facilitates acetylation of 
H4 by p300 (why it is associated with 
activation.
• H3­K9 methylation creates a binding site for 
HP1 and HP1 is known to associate with 
HDACs and involved in heterochromatin 
formation (why it is involved in repression)
• The underlining mechanism for many other 
modifications is not clear 
   
 Histone phosphorylation

• Phosphorylation on Ser­10 of H3 is involved in 
both transcriptional activation and in chromosome 
condensation during mitosis.
• Phosphorylation on Ser­10 of H3 facilitates 
acetylation of histone H3 on Lys­9 and Lys­14.
• Phosphorylation of histone H2X variant is involved 
in DNA repair
• Many Ser and Thr sites in histone tails can be 
phosphorylated. In most cases the functional 
consequence is not clear.
   
 Histone Ubiqitination
• H2A (Lys­119) and H2B (Lys­123) can be 
mono­ubiqitinated.
• Mono­ubiqitination is not associated with 
protein degradation by proteasome 
pathway.
• H2B ubiqitination in yeast is catalyzed by 
Rad6 and is required for methylation on Lys­
4 and Lys­79. The underlining mechanism is 
unknown.
   
Interplay Between Different Histone Modifications

Me
Me Me Ac p Ac Me Ac Ac Me Me p
Human H3 N­ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP...
4 9 14 18 23 27
Me

Me Ac Ac Ac Ac Me
Human H4 Ac­N­SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGIT...
3 5 8 12 16 20

   
 Multiple modifications and enormous potential 
  combinations: histone code theory 
 
 ‘Histone Code’ and How the Code be Read?

Histone code hypothesis: that multiple histone modifications, acting in 
       combinatorial or sequential fashion on one or multiple histone tails, 
       specify unique downstream functions.

How the histone code be read? 
Likely read by specific protein domains

Code Protein Motif
Ac­Lys Bromo

Me­K9 HP1 Chromo

Me­K27 Polycomb Chromo

Phos­S10 ?

Different combinations ?
   
 Optimal transcriptional activation 
requires multiple chromatin remodeling 
factors

   
 Functional interplay among different 
chromatin remodeling factors?

The functions of SWI/SNF and the 
SAGA complex are genetically linked

• Some genes require both complexes for 
activation.
• Other genes require one or the other complex.
• Many genes require neither ­ presumably utilize 
different ATP­dependent complexes and/or HATs
   
 The Order of Recruitment?
The yeast HO endonuclease gene requires both SWI/SNF 
and SAGA
• The order of recruitment at the HO promoter:
– 1. SWI5 activator: sequence recognition
– 2. SWI/SNF complex: remodel nucleosomes
– 3. SAGA: acetylate histones
– 4. SBF activator (still at specific sequences)
– 5. general transcription factors
• Cosma, Tanaka and Nasmyth (1999) Cell 97:299­
311.
• The order is likely to differ at different genes
   
 A scenario for transitions from 
silenced to open to actively 
transcribed chromatin

   
Movement from hetero­ to euchromatin

   
Nucleosome 
remodelers 
and HATs 
further open 
chromatin

   
Assembly of 
preinitiation 
complex on 
open 
chromatin