Cultivo de Células Animales Presentacion Final

Cultivo de clulas animales
Mara Isabel Correa Estrada Alejandra Muoz Rendn
PARA EL DESARROLLO DE UNA SUSTANCIA NUEVA CON ACTIVIDAD BIOLOGICA

1. 2. 3. 4. 5. 6.
Ingeniera gentica Seleccin de la lnea celular y del clon Definicin y optimizacin del medio de cultivo Caracterizacin de las clulas Determinacin de las estrategias ptimas de cultivo Evaluacin de la calidad y actividad del producto obtenido.
Siglo XIX Estudio del comportamiento de clulas animales. Actualmente Cultivos en laboratorios, de clulas procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. Condiciones de crecimiento Temperatura, mezcla de gases y pH. Medio de cultivo Factores de crecimiento, indicadores de pH, antibiticos y antimicticos.
Aplicaciones
Ingeniera de tejidos y rganos Terapia gnica
Biofarmacologa
Medicina Toxicologa y fisiologa in vitro Nanobiotecnologa Dispositivos bioelectromecnicos
Ventajas
Produccin de protenas altamente similares a las humanas. Procesamientos complejos, como la glicosilacin. Mercado de ms de diez mil millones de dlares anuales.
Bajas velocidades de crecimiento Largos tiempos de cultivo. Uso de suplementos y medios de cultivo costosos. Fragilidad de las clulas.
Desventajas
Potencial presencia de virus endgenos. Equipos, instalaciones y bioprocesos son sofisticados y costosos. Bajas productividades.
Incalculable impacto en el incremento de la calidad de vida y salud humana.
Procedencia del cultivo
Tejidos
Epitelial Conectivo Muscular Nervioso
Fluidos y otros
Sistema hematopoytico
Mdula sea Tejido linfoide
Crecen adheridas a una superficie y formando monocapa
Crecen suspendidas en forma esfrica
Clasificacin del cultivo celular
Tipos de cultivos celulares
http://www.innoprot.com/es_productos _escaparate.asp
Lneas celulares en la biofarmacologa
Aplicaciones industriales
Principales lneas celulares: Ovario de Hmster Chino (CHO) Mieloma de ratn SP2/0
Mieloma de ratn NS0 Usadas para producir 11 de los 21 productos aprobados por la FDA (Food and Drug Administration) entre los aos 1996 y 2000
Vacunas y tejidos para transplantes
Protenas o anticuerpos recombinantes
http://www.smbb.com.mx/anuncios /applikon/applikon.html
Dao debido a la agitacin y aireacin: Diseo y control de los biorreactores Pluronic F68. Acumulacin de productos residuales: Sistemas en perfusin Expresin de la glutamina sintetasa (Celltech).
Calidad de productos
Activador tisular t-PA:
Rata de crecimiento Estado de las clulas

mAB humano, Synagis: Tiempo de cultivo Fed-Batch Medio libre de suero
Biorreactores y tipos de operacin utilizados

Cultivo de clulas adherentes

Botella cilndrica Sistemas de platos apilados Microportadores suspendidos en tanques agitados No tradicionales: Biorreactor de columna de burbujeo, Reactor de membrana de dilisis, reactor de lecho empacado en perfusin
Usadas en campo especializados: Produccin de eritropoyetina Terapia gnica Produccin de vacunas
Cultivo de clulas adherentes

Microportadores suspendidos en tanques agitados: Escalas por encima de 10000 L Optimizacin ms eficiente Flexibilidad en el diseo de la alimentacin Perfusin Filtros Spin Concentracin para aumentar el rea superficial Diseo del agitador para altas cantidades de microportadores.
Clulas adherentes
Microaireacin con O2 puro previene el dao por gaseado excesivo Acumulacin de CO2
Es muy necesario el uso de sueros y protenas en el medio de cultivo Mayor probabilidad de contaminacin
Produccin de protenas y anticuerpos: Suspensiones en tanques agitados con alimentacin controlada (Fed-Batch, Perfusin, etc.). Cultivos a gran escala: o o o o o Maximizar la productividad Mantener la calidad del producto Remover componentes no deseados en el cultivo Minimizar la contaminacin Controlar la remocin de CO2.
ESCALADO
Rata de transferencia de masa Agitacin Sensibilidad a los esfuerzos cortantes
Balance
Criterios de seleccin de un sistema de cultivo celular

Operacin estril Agitacin sin causar dao las clulas sensibles
Facilidad del escalado Posibilidad de automatizacin y control del proceso
Suficiente transferencia Compatibilidad con los de gas (O2 y CO2) procesos aguas arriba y aguas abajo
Modos de operacin reportados
Batch o Fed-Batch STRs

8-10 m3 15 m3
Continuos en perfusin
Ms comn para produccin de protena.
Escala Utilizada
Reactor Utilizado
Productividad de la lnea celular
Cantidad de producto requerida
PROTENAS TERAPUTICAS
(kg/ao)
ANTICUERPOS MONOCLONALES
EL ESCALADO EXITOSO: Cortos perodos de tiempo. Ahorra en costos de produccin. Ofrece ventajas competitivas.
VARIACIONES EN LAS PRODUCCIONES REQUERIDAS

AGITACIN
Nmero de Bodenstein (Bo):
Nmero de Peclet (Pe)
Indicador de
o Mezcla en distintas regiones del reactor o ndice de mezcla longitudinal
Tambin usado para caracterizar la agitacin o mezcla
Pe = vD/ D1
D: Dimetro del tanque
Bo= Lv/ D1
L: Longitud caracterstica v: velocidad media D1 : Difusividad axial
USADOS EN STRs Y EN AIRLIFTS Cultivo de clulas animales
Gradientes de pH
Dispersin de los nutrientes
FACTORES CRTICOS EN EL CULTIVO
Productos de desecho
Aireacin
TRANSFERENCIA DE MASA
Nutrientes Productos txicos Gases
Micro Macro Lactato Amonio
O2 CO2
Requerimientos de O2
Dependientes de la lnea celular Lneas celulares comerciales comunes:

2.5 mg/108 cel*h
Clulas humanas:
0.5 (mmol/L* h)
Para 106 cel/mL
0.05 (mmol/L* h)
0.1 mg/108 cel*h
Transferencia de gas
La mayora de las correlaciones realizadas para obtener kLa no son apropiadas para los cultivos de clulas animales
Membranas permeables al gas

Esparcimiento directo de aire u oxgeno Esparcimiento de oxgeno puro usando dispositivos especiales
Generacin in situ de oxgeno usando:

Perxido de hidrgeno Peroxidasas
Mtodos de aireacin
Enfoque: Diseo de inyectores de gas Disolucin completa de las burbujas antes de que alcancen la superficie
Transferir gas sin producir burbujas
Membranas permeables
Tubos vibratorios de silicona
Burbujas
Zhang et al. (1992) midieron las ratas de transferencia de
oxgeno en bioreactores aireados de clulas animales, como

funcin del dimetro de burbuja.
Los dimetros de burbuja estudiados fueron:

5 mm 1 mm 100 m
La transferencia aumenta a medida que el dimetro de la burbuja disminuye
Burbujas
En las clulas animales los dimetros de burbuja estarn casi siembre entre 46 mm.
Regmenes de formacin de las burbujas

1. 2. 3. Formacin de burbujas separadas. Burbujeo en cadena Rgimen jet ((Re) >2000)
4.
Rgimen turbulento
1.Burbujas separadas
2.Burbujeo en cadena
Transferencia del CO2

Producto del metabolismo Su transferencia de la solucin a las burbujas de gas clulas animales
Aumentos en CO2 Aumentos en HCO3Disminucin en el pH
Crtica para las
ESFUERZOS CORTANTES
Posibles causas del dao celular
1 2
Colisiones directas de las clulas con los aspersores y/o baffles Diferencias de presin entre la parte frontal y tracera de los impulsores Turbulencia mediada por las diferencias en las longitudes del vector del campo del flujo no laminar Microeddies con dimetro menos al dimetro celular
3
4
Interacciones clula-burbuja
Regiones principales donde puede ocurrir el dao:

1. Regin de generacin de la burbuja (Incluyendo la
regin donde el aspersor induce incorporacin y

rompimiento) 2. Regin de ascensin de la burbuja 3. Regin de rompimiento de la burbuja
Depende tambin de la lnea celular y su resistencia a la deformacin.

Tramper et al (1987)
En columnas de burbujeo
Jobses et al (1991)
Muerte celular por contacto con las burbujas
Kioukia et al. (1992)
Efectos del esfuerzo cortante segn la etapa de crecimiento
Estado de crecimiento del inculo

Mayor fragilidad Mayor resistencia Fases: lag y estacionaria Fase exponencial
Si la lnea celular se desarroll desde la fase de laboratorio en cultivos bien agitados Menos sensible. Si las clulas estn expuestas a un ambiente altamente inhibitorio ms sensibles.
Temperatura del fluido
Concentracin celular
Otros factores
Caractersticas de las superficies contenedoras
Historia de estrs y deformacin de la muestra
Concluyendo
1.
Muchas
suspensiones
celulares
4.
Los esfuerzos mecnicos afectan tambin:
(hibridomas) no son tan sensibles a
los esfuerzos cortantes como se

pensaba.
Homogenizacin
Transferencia de masa Formacin de producto Suspensin de las clulas
2.
En STRs la muerte celular ocurre
principalmente
las burbujas
por el estallido de
5.
La
aireacin que
combinada posibles dejan un
con
la
agitacin
3.
tiene
efectos rango
La muerte celular en suspensiones
nocivos
aumenta
remolinos
a
de
medida
que
los
se
limitado de velocidades de agitacin disponibles.
Kolmogorov
aproximan al tamao de las clulas
PRESIN
La presin afecta:

Solubilidades del O2 y CO2 El tamao de las burbujas La viabilidad y fisiologa celulares Pocos estudios Takagi et al. (1995):
Efectos de variaciones de 0.1 a 0.9 MPa.
Cambios en las ratas de conversin
Glucosa a lactato
Consumo de glutamina
Aumento del 20% en la rata especfica de produccin de anticuerpos monoclonales, con el incremento de presin.
CRITERIOS PARA ESCALADO ASCENDENTE

Criterios

Dimensiones del reactor. kLa. Tasa de deformacin (valor mximo). P/V (muy usado en cultivos microbianos). Flujo volumtrico de gas por unidad de volumen de lquido. Velocidad superficial de gas. Tiempo de mezcla (no muy usado). Velocidad en la punta del impulsor (para STRs).
ESCALADO DESCENDENTE
Para qu se usa ?

Entender fenmenos vistos Mejoramiento de procesos La similitud geomtrica no es un parmetro necesariamente importante.
Lo ms importante es encontrar en la pequea

escala las mismas constantes cinticas del proceso realizado en la escala original.
Optimizacin de los procesos.

TIPOS DE REACTORES
A PEQUEA ESCALA

Biorreactores desechables Hexascreen mini biorreactores
Biorreactores desechables
1. Filtro de venteo 2. Puerto de sobrepresin de gases de salida 3. Puertos para adicin de medio de cultivo y otros componentes 4. Sello de cojinete para el agitador 5. Impulsor de polietileno moldeado ensamblado por una tubera que da la forma al agitador 6. Puertos para la integracin de electrodos de pH y oxgeno disuelto estndar de 1/2 pulgada 7. Puerto para el sensor de temperatura 8. Puerto de muestreo 9. Puerto para drenado 10.Sistema de aireacin
1. Contenedor de acero inoxidable 304 2. Motor 3. Chaqueta de calentamiento 4. Plataforma 5. Unidad de control de temperatura y Mezclado nicamente.
Los parmetros de cultivo son controlados por sistemas adicionales convencionales.
www.hyclone.com www.xcellerx.com www.startorious-ste Diagrama de los perfiles de flujo de un Wave Bioreactor. Cultivo de clulas animales
Fabricantes:
Thermofisher Xcellerx Startorius-stedim GE healthcare Applikon Amprotein Cellexus Biosystems Atmi-lifescience Pall Co Upfront Chromtography
Hexascreen mini Biorreactores

Volmenes entre 10 y 15 mL Seis experimentos en paralelo y monitoreo en lnea Sistema adecuado tanto para cultivos en suspensin como adherentes Informacin cintica en tiempo real del crecimiento celular y la actividad metablica: concentracin de clulas (OD), oxgeno disuelto y pH.
A GRAN ESCALA
Tanques agitados (STRs)
Fermentadores air-lift
Columnas de burbujeo
Reactores de lecho empacado

Reactores de lecho fluidizado Reactores de membrana
En general
Se prefieren los sistemas de suspensin a los de inmovilizacin.

o Se operaban en modo Fed-Batch y luego se impuso el cultivo en perfusin.
Sistemas de Inmovilizacin:
o Fibra hueca o Lechos de vidrio
o Microportadores
Los ltimos pueden presentar problemas

Heterogeneidad en el pH y la TOD
Tanques Agitados
Consideraciones del Diseo: Velocidad del Impulsor. Geometra del impulsor (Di, Hi) Relacin (Di/Dt) Detalles del aspersor Tasas de flujo gaseoso Ubicacin de alimentaciones Alclis Puntos de muestreo Diseo de la base del tanque Sondas de pH y OD Diseo del eje del impulsor (Motores y sellos) Bafles Control de la Temperatura Relacin de aspecto
Tanques Agitados
Hidrodinmica:
La
dispersin
del
gas
debe
encontrarse
generalmente en el rgimen de inundacin.
Eleccin de impulsor: Altos nmeros de flujo (Fl) y bajos nmeros de potencia (Np).
Grandes impulsores agitando lentamente.
Impulsores de turbina: Dainos para muchas lneas celulares Propela marina: Se ha utilizado ampliamente
Relacin de aspecto: Se prefieren altas. Alturas muy grandes pueden afectar:

Control y monitoreo de pH. Presin hidrosttica en el tanque.
Reactores Airlift:
Consideraciones del Diseo Relacin de aspecto Detalles del aspersor Flujo gaseoso Posicin de alimentaciones Alkali Puntos de muestreo Sondas para pH y OD Diseo de la base del tanque Control de la temperatura
TANQUE AGITADO
AIRLIFT
Similitud geomtrica
Similitud geomtrica
Esfuerzos cortantes
constantes (Velocidad en la punta del
Kla
Velocidad superficial del gas
impulsor)

Rata de flujo de gas por

unidad de volumen Tiempo de mezcla
Kla QG / V
ESCALADO
Comparacin entre los sistemas

Relacin de aspecto ms favorable para el adecuado mezclado en el caso de tanques agitados. Ratas de flujo de gas similares.
Mayor flexibilidad en la perfusin, particularmente respecto al uso de filtros.
Mecanismos para incrementar la productividad

Adems de cambios en el diseo del reactor, condiciones del proceso y remocin de compuestos, se ha probado: Adicin de agentes osmoprotectores Adicin de glutamina Adicin de butirato de sodio
Retos
Estrs hidrodinmico Apoptosis Productividad
Agitacin Aireacin
Sulfactantes Plurnicos
Disponibilidad de oxgeno y nutrientes Elevacin de T Disminucin de pH
Cantidad Calidad Remocin de compuestos no deseados Contaminacin
Bibliografa
Palomares L. A., Valdez N.A. y Ramrez O.T. (2007) Superando los retos de clulas animales a travs de la bioingeniera. Biotecnologa, Vol. 14, pp. 385399. Tavira C. A., Ortega A., Dvila I., Estrada S. y Meneses A (2009) Alcances y perspectivas del cultivo de clulas animales en la biotecnologa farmacutica. Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, Vol. 40, Nm. 4, pp. 35-46. Chu L. and Robinson D.K. (2001) Industrial choices for protein production by large-scale cell culture. Biochemical engineering, Vol. 12, pp. 180-187
Bibliografa
Varley J. and Birch J. (1999) Reactor design for large scale suspension animal cell culture. Citotechnology, Vol. 29, pp. 177-205. Trujillo M.A. y Valdez N.A. (2009) El uso de biorreactores desechables en la industria Biofarmacutica y sus implicaciones en la ingeniera. Dyna, Vol. 76, Nm. 158, pp. 275-283

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Incalculable impacto en el incremento de la calidad de vida y salud humana.

Cultivo de clulas animales

Procedencia del cultivo

Crecen adheridas a una superficie y formando monocapa

Crecen suspendidas en forma esfrica

Cultivo de clulas animales

Clasificacin del cultivo celular

Cultivo de clulas animales

Tipos de cultivos celulares

Cultivo de clulas animales

Lneas celulares en la biofarmacologa

Cultivo de clulas animales

Vacunas y tejidos para transplantes

Protenas o anticuerpos recombinantes

Cultivo de clulas animales

Rata de crecimiento Estado de las clulas

Cultivo de clulas animales

Cultivo de clulas animales

Cultivo de clulas animales

Biorreactores y tipos de operacin utilizados

Cultivo de clulas adherentes

Usadas en campo especializados: Produccin de eritropoyetina Terapia gnica Produccin de vacunas

Cultivo de clulas animales

Cultivo de clulas adherentes

Cultivo de clulas animales

Cultivo de clulas animales

Rata de transferencia de masa Agitacin Sensibilidad a los esfuerzos cortantes

Cultivo de clulas animales

Criterios de seleccin de un sistema de cultivo celular

Operacin estril Agitacin sin causar dao las clulas sensibles

Facilidad del escalado Posibilidad de automatizacin y control del proceso

Modos de operacin reportados

Batch o Fed-Batch STRs

Cultivo de clulas animales

Productividad de la lnea celular

Cantidad de producto requerida

Cultivo de clulas animales

VARIACIONES EN LAS PRODUCCIONES REQUERIDAS

Nmero de Bodenstein (Bo):

Nmero de Peclet (Pe)

Tambin usado para caracterizar la agitacin o mezcla

USADOS EN STRs Y EN AIRLIFTS Cultivo de clulas animales

Dispersin de los nutrientes

FACTORES CRTICOS EN EL CULTIVO

Cultivo de clulas animales

Nutrientes Productos txicos Gases

Micro Macro Lactato Amonio

Cultivo de clulas animales

Dependientes de la lnea celular Lneas celulares comerciales comunes:

0.1 mg/108 cel*h

Cultivo de clulas animales

Cultivo de clulas animales

Membranas permeables al gas

Generacin in situ de oxgeno usando:

Transferir gas sin producir burbujas

Tubos vibratorios de silicona

Cultivo de clulas animales

Zhang et al. (1992) midieron las ratas de transferencia de

oxgeno en bioreactores aireados de clulas animales, como