Objetivos:

Aprender a trabajar con soluciones calibradoras. Validar una curva de calibracin. Aprender a utilizar la regresin lineal para el anlisis de las curvas de calibracin.

 Qu es una curva de calibracin?

Se trata de una curva de referencia construida a partir de la respuesta de cantidades conocidas de un analito ante una reaccin. Se utiliza para determinar la cantidad del analito (ej. protenas) presente en una muestra incgnita. Se relaciona la concentracin del analito con la intensidad de color que genera una reaccin. La relacin mientras sea lineal cumple con la ley de LambertBeer.

La intensidad del color se puede determinar por el mtodo fotocolorimtrico.

Fotocolorimetra:
- Incide un haz de luz monocromtico perpendicularmente a un tubo de solucin coloreada.
- Parte de energa incidente (I0) es absorbida por la solucin y otra transmitida (I1)
- I1 depende de c= concentracin solucin(moles / L) l= distancia atravesada por la luz = coeficiente de extincin molar

-Segn la ley de Lambert-Beer: I0 = I1 x 10-x x c I0 = 10-x x c I1

Log I0 = x x c I1

x x c= A

A= absorbancia y = cte.= factor de

calibracin

A=k x c Ec. de una recta que pasa por origen.

c=A

As se puede determinar la concentracin de la solucin problema.

MATERIALES
Materiales de Laboratorio: A) Matraces aforados B) Vasos precipitados C) Puntas para p100, p200 D) Tubos Khan de vidrio Equipos:

A) Espectrofotmetro
B) Micropipetas automticas C) Balanza analtica

Materiales de laboratorio:
Matraz aforado:
Recipiente con un fondo plano y un cuello largo y delgado. una marca alrededor del cuello que indica un determinado volumen de lquido. Vasos precipitados: Contenedor de lquidos, cilndricos, con fondo plano; tiene capacidades que van desde 1 mL. hasta varios litros. Son de vidrio o de plstico. Aqullos cuyo objetivo es contener cidos o qumicos corrosivos, tienen componentes resistentes a la corrosin.

Suelen estar graduados, pero esta graduacin es inexacta

Puntas o tips para p100 y p200: Sirven para tomar volmenes con las micropipetas. Se debe procurar no presionar la punta muy fuerte a la micropipeta.

Tubos Khan de vidrio Son tubos sellados que se usan para el transporte de muestras (ej. sangre). Tienen una presin interna menor a la externa de manera que al insertar la aguja, el fluido en su interior sale por diferencia de presiones.

Espectrofotmetro
Es un instrumento que se usa para medir la absorbancia de una muestra en funcin de la longitud de onda de la radiacin electromagntica. El espectrofotmetro consta de los siguientes componentes clave: fuente, dispositivo de dispersin, rea de muestra y uno o ms detectores.

Fuente genera radiacin electromagntica: Puede que genere luz de longitudes de onda entre 400-700 nm, o bien para la zona ultravioleta (200-400 nm). El dispositivo de dispersin: selecciona una determinada longitud de onda. El rea de muestra es donde se contiene el material bajo estudio.

El detector sirve para medir la intensidad de la radiacin.

Micropipetas automticas
Nos sirven para medir con exactitud y reproducibilidad volmenes cuyo orden es el de los microlitros (106L ). Los errores de medicin que se pueden cometer dependen en gran medida del usuario y no de la micropipeta.

Balanza Analtica
Instrumento que sirve para pesar elementos cuya capacidad va desde 1 gr. hasta algunos Kg. Se usa en casos en que se necesita una alta precisin como en el caso de la confeccin de las curvas de calibracin.

Construccin de la curva de calibracin:

Preparar varias concentraciones lo ms exactas posibles (soluciones calibradoras) de lo que se desea analizar, a partir de una solucin patrn o estndar. Para la preparacin de los calibradores (sustancias qumicas de certificada pureza) se debe utilizar un diluyente puro el cual debe ser medido con exactitud.

A cada tubo se le agrega la solucin patrn ( ej. : estndar de glicgeno 0.025% ) en diferentes concentraciones dependiendo del rango del mtodo, excepto el blanco.
Todos los tubos debern tener el mismo volumen final, por lo que hay que diluir con agua destilada, y agitar. Luego se agrega el reactivo: ej. reactivo de Biuret. Mtodo de Biuret va a ser especifico para las protenas, ya que contiene Cu en se composicin por lo que se unir al enlace pepitico, que se manifiesta en el color violeta de la solucin.

Se mide la variacin de color en el espectrofotmetro a 480 nm. siempre ajustando a cero la maquina con el blanco antes de medir la absorbancia.

Al final se obtienen las absorbancias para las diferentes concentraciones de los patrones y se puede hacer la curva de calibracin. As se puede obtener el factor de calibracin. Cundo no se cumple la ley de L-B?
A partir de concentraciones 0.01M hay desviaciones de linealidad. radiacin no monocromtica. Existencia de otros equilibrios en la solucin (acido-base, formacin de complejos) ya que se modifican la concentracin de la sustancia estudiada.

Validacin de la Curva de Calibracin

Para validar los resultados obtenidos de un experimento se deben tener en cuenta los siguientes factores:

- Los clculos que se realizan para las mediciones deben incluir la menor cantidad de pipetas y micropipetas. - Preparar por lo menos 3 concentraciones de la sustancia de inters. - La construccin de la curva debe incluir los intervalos de confianza. - Validacin por mtodos estadsticos

Lmite de deteccin: Cantidad medida ms pequea de analito que

puede ser detectado en una medicin nica con cierto nivel de confianza.

Lmite de cuantificacin: Cantidad medida ms pequea de analito

que puede ser determinada cuantitativamente con exactitud aceptable.

Especificidad: Habilidad del procedimiento analtico de evaluar

solamente un determinado analito, aunque se encuentre en presencia de ms sustancias en el sistema.

Regresin lineal: Mtodo para obtener la relacin ms precisa entre

la variable independiente y los mltiples valores que puede tomar la variable dependiente.

Permite encontrar la ecuacin de la recta que mejor asocia los valores de las mediciones experimentales presentes en la curva de calibracin.

Y = seal medida X = variable independiente a = coeficiente lineal b = coeficiente angular

Desviacin estndar: Mtodo utilizado para medir la dispersin de

los valores de las mediciones respecto a su promedio.

Error estndar: Corresponde a la desviacin estndar de los

promedios muestrales en el conjunto de valores de los resultados obtenidos

Intervalo de confianza: Es el rango dentro del cual puede estimarse

que los resultados de las mediciones obtenidas se encuentran posicionados. Por lo tanto su estimacin se presenta entre un lmite inferior y uno superior.

Exactitud: Grado de cercana entre un valor aceptado (el verdadero)

y el valor obtenido.

Grado de inexactitud

Grado de exactitud

Precisin: Nivel de coincidencia entre los resultados obtenidos de

una misma muestra y bajo mismas condiciones. Se expresa por el coeficiente de variacin que corresponde a la variacin estndar relativa.

Grado de imprecisin

Grado de precisin

Esta asociado a la repetibilidad de una operacin.

Repetibilidad: Precisin obtenida en los resultados de un

procedimiento sometido a las mismas condiciones. stas involucran el tiempo, el operador, mtodo, el ambiente, la misma muestra, el equipo, los materiales.

Reproducibilidad: Precisin obtenida en los resultados de un

procedimiento sometido a diferentes condiciones. Aplicado a estudios interlaboratoriales para estandarizar una metodologa.

Ejemplo: DETERMINACION DE LA GLICEMIA

Solucin patrn de glucosa 0.2 mg/ml rango :0.01- 0.2mg

Se preparan 4 tubos con diferentes concentraciones de glucosa a partir de la solucin patrn. Entonces si: 0.2 mg1ml x=0.25ml 0.05mg X -Se hace lo mismo para todas las concentraciones, quedando:
Tubo
Glucosa 0.2 mg/ml (ml) Mg glucosa Muestra problema (ml) H2 O

1 0.25 0.05 -

2 0.5 0.1 -

3 0.75 0.15 -

4 1 0.2 -

blanco -

Muestra problema 1

0.75

0.5

0.25

Despus se mezclan y se ponen a hervir por 10 minutos, luego se sacan y sin agitar se enfran. Se agregan 1 ml de reactivo de somogyi a todos los tubos.

Se mezcla nuevamente y se agregan 7 ml de agua destilada

Mezclar y determinar absorbancia a 540 nm, y se obtiene:
Tubos
1 2 3 4 5 Muestra problema

mg de Glucosa
0,0 0,05 0,1 0,15 0,2 -

Absorbancia (540 nm)

0 0,27 0,56 0,79 1,11 0,41

Como la ec. es y = 5.4667x Pendiente= 5.4667= k= factor de calibracin. Como la muestra problema tiene una A de 0.41, y como k= 5.4667 podemos calcular la concentracin del analito: c=A/k c= 0.41/ 5.4667 c= 0.0749 mg/ ml

Curva de Calibracin
Absorbancia (540 nm)
y = 5,4667x 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 mg de Glucosa