Luminex®

Principe et applications en HLA

Pr H.AMROUN
 1- Introduction:

La technologie Luminex® :
•Nouvelle technologie, qui allie les compétences de la technique de cytométrie en
flux à deux lasers et l’utilisation de microbilles en polystyrène.
•Système multi-analytique puissant avec de grandes capacités d’analyses.
(100 microbilles différentes inclues dans un même puits.)
• Système de dosage caractérisé par:
La miniaturisation permet de limiter les volumes d’échantillons.
Le multiplexage correspond à l’analyse de plusieurs paramètres simultanément.
L’automatisation permet de réaliser un grand nombre d’analyses en un temps
réduit.
•Susceptible d’intéresser de nombreuses disciplines biologiques:
 2- Description du système
Microsphères (Billes)
-Billes en polystyrène de 5,6 μm de diamètre (3 à 7 μm ) exp: dosage de cytokine
-Fixation de molécules par liaison covalente.
- Incorporation de 2 fluorochromes dans les billes  chaque bille a son propre code
couleur.

Solution de coloration

2 fluorochromes rouge + infra rouge

sont mélangés dans un ratio unique
+
solvant organique

Fluorochromes pénètrent à
l’intérieur des microsphères
 2- Description du système
Microsphères (Billes)
L’intensité du mélange définit une catégorie de billes ratio unique de rouge et
d’infrarouge (code couleur unique pour chaque bille)

Les différentes populations de microsphères sont ensuite numérotées informatiquement afin

de les associer aux futurs analytes qui leur seront assignés.
 2- Description du système
Microsphères (Billes)
COUPLAGE DES MICROBILLES AUX MOLECULES DE CAPTURE

COUPLAGE DES MICROBILLES AUX MOLECULES DE CAPTURE

-Les billes, via leurs groupements carboxyle, servent de support solide à différentes molécules se
liant de façon covalente par des groupements aminés
 2- Description du système
Microsphères (Billes)
COUPLAGE DES MICROBILLES AUX MOLECULES DE CAPTURE

COUPLAGE DES MICROBILLES AUX MOLECULES DE CAPTURE

Non spécifique

Adsorption
Inconvénient:
Possibilité de détachement de la
molécule de capture.

Couplage
- La surface de la bille: carboxyles,
amines/hydrazides…
- La molécule de capture: groupements
amines.

Liaison covalente
Liaison de haute affinité:
Biotine-avidine
Anti-immunoglobuline
3- L’appareil luminex

Système informatique
 3- L’appareil luminex

Aiguille : aspiration du
mélange réactionnel du
puits vers la veine liquide

•Les microsphères sont aspirées

et alignées une à une dans la
veine liquide.
•Séparées et identifiées pdt la
phase de l’acquisition des
données.
•A la sortie de la veine liquide
elles sont excitées par les deux
lasers dont l’un analyse la couleur
interne de la bille et l’autre
l’intensité de fluorescence à la
surface de la bille.
Plaque de 96 puits: chaque puits correspond
à un patient
 3- L’appareil luminex

Système de lecture: double laser

L’immunofluorimètre en flux contient

3 stations de lecture pour le laser rouge
1. mesure du rouge
2. mesure de l’infra rouge
3. élimination des agglutinats
 3- L’appareil luminex

Système de lecture: double laser

Quantification
Le laser vert analyse la fluorescence à la surface de la microbille, la quantifie par rapport à une
calibration. Celle-ci étant directement proportionnelle à la quantité de conjugué fixé.

Identification
Le laser rouge identifie la signature de chaque microbille
et par extension de chaque antigène ou anticorps
 3- L’appareil luminex

Logiciel d’acquisition

Bead ID

Comptage des billes lors de l’acquisition

Pic d’acquisition des données

On peut suivre en temps réel cette acquisition:

- Progression du pic d’acquisition des données.
 3- L’appareil luminex

Logiciel d’acquisition

Classification des nuages de billes selon les

fluorescences rouge et infrarouge émises

 Les nuages de microsphères correspondent aux différentes catégories.

 Leur positionnement correspond à leur code couleur.
 Suivre le positionnement du nuage de billes au sein d’un masque préétabli.
 Chaque nuage correspondant à un lot de microsphères.
 AVANTAGES
AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS
INCONVÉNIENTS

• Sensibilité;
• Coût;
• Spécificité;
• Matrice liquide dans laquelle se
• faible volume d’échantillon ;
déroule la réaction est critique;
• Possibilité de multiplexage;
• Pas de détection séparée des
• facilité et rapidité d’exécution
Ac d’isotypes différents.
• Automatisation;
• Application à une multitude de
systèmes (dosage de cytokines,
typage HLA…).
5- Applications
 Typage HLA

C’est une PCR SSO Réverse en milieu liquide qui se déroule en plusieurs étapes:

Exon 2
Amplification des exons sélectionnés selon le
typage, en présence de Taq polymérase et
des primers biotinylés

Hybridation entre les oligo-nucléotides fixés

sur les billes et l’ADN amplifié marqué ;
Remarque: Sur chaque type de microsphères
est fixé un oligonucléotide unique.

Révélation des fragments d’ADN fixés

sur les billes par la
streptavidine/phycoérythrine.
 Typage HLA

Laser vert Phycoèrythrine

Laser rouge

Streptavidine
Amplicon
Biotinylé

Sonde
Biotine

Bille
Recherche et identification d’anticorps anti HLA
Détection des anticorps anti HLA par Luminex:
Principe général

Laser vert

PE
Ac du
patient

Ag
Conjugué:
Anti IgG-PE

Bille
Laser rouge
 Recherche et identification d’anticorps anti HLA
1- Recherche d’anticorps anti HLA:
SCREENING

Les billes sont coatées avec les Ag HLA de 300 donneurs (Classe I), et 30 donneurs (Classe II).
Le Screening permet de détecter la présence d’Ac anti HLA sans pouvoir connaitre la cible
HLA de ces Ac.

01 jeu de 7 billes coatées avec des antigènes de classe I (A, B, Cw)

01 jeu de 5 billes coatées avec des antigènes de classe II (DR, DQ, DP)
01 jeu de billes contrôle positif.
03 jeux de billes contrôles négatifs.
Recherche et identification d’anticorps anti HLA
1- Recherche d’anticorps anti HLA:
SCREENING
Résultats du Screening
Critères de validation
1- Dépistage
– Classe I :
• Bille 1 : pool 300 donneurs
• Billes 2 à 7 enrichies

– Classe II
• Bille 1 : pool 30 donneurs
• Billes 2 à 5 enrichies.

– 3 billes contrôles : CON1,2,3 (contrôle du sérum)

– 1 bille témoin positif PC (contrôle du conjugué)
– 1 sérum témoin négatif (contrôle de manipulation)
– 1 sérum témoin positif. (contrôle de contamination)

– Validation du run
• PC des témoins neg et pos > 10000
• MFI des billes 1 du sérum témoin pos > 10000
– Validation des échantillons
• PC > 3500
• CON dans les limites
– Echantillon Positif si :
• Billes 1 : au moins 1 Adj > 0
• Autres billes : au moins
 Recherche et identification d’anticorps anti HLA
1- Identification des anticorps anti HLA:
Détermination du PRA

Test de screening positif Identification.

Les billes sont coatées avec les Ag HLA de 50 donneurs (Classe I), et 30
donneurs (Classe II)
Chaque bille Antigènes HLA d’un sujet.
Le PRA reflète le taux de réactivité du patient face à un panel de
molécules HLA.

01 jeu de billes contrôle positif

03 jeux de billes contrôles négatifs
Recherche et identification d’anticorps anti HLA
1- Identification des anticorps anti HLA:
Détermination du PRA
Résultats du Screening
 Recherche et identification d’anticorps anti HLA
1- Identification des anticorps anti HLA:
Haute définition
Utilisation de molécules HLA recombinantes (Classe I et classe II)
96 billes Luminex
Chaque bille ne porte qu’une spécificité HLA
 Cross Match Luminex

HLA I HLA II

HLA II
HLA I
 Cross Match Luminex
Cross Match Luminex: Avantages, inconvénients

Bonne sensibilité
IgM anti HLA non détectés
Bonne Spécificité
Fixation variable des antigènes du
Viabilité cellulaire sans effet
donneur
Détection de touts les isotypes IgG
Technique consommatrice de cellules
Conservation du lysat cellulaire à -80°c