LAS CÉLULAS

La Teoría Celular
• Cuando Scheiden y Schwann propusieron la teoría celular
en 1838, la investigación de la biología celular cambió
para siempre.
• La teoría celular dice lo siguiente:
– Todas las formas de vida nacen de una o más
células.
– Las células se producen solamente de células
preexistentes.
– La célula es la forma de vida más pequeña.
• La teoría celular también nos provee con una definición
operacional de "vida".
Microscopios
Microscopio Óptico Microscopio electrónico
 La mayoría de los estudios sobre la
fisiología celular requieren para su análisis
el aislamiento del componente celular a ser
analizado

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

En Biología Celular existen un conjunto de métodos y técnicas que

basándose en la ley de la gravedad tienen como objetivo obtener fracciones
puras o enriquecidas de un determinado componente celular.
En algunos casos la separación de
partículas puede realizarse directamente
por sedimentación sin necesidad de
aumentar la fuerza de la gravedad siendo
esto lo utilizado en el caso de
sedimentación de células enteras como
células sanguíneas o microorganismos
pero en la mayoría de los casos para la
separación de partículas u organelas que
no presentan una tendencia a sedimentar
espontáneamente se requiere aumentar
la fuerza gravitatoria a través de la
centrifugación .
 FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
Es un conjunto de métodos y técnicas que basándose en la ley de la gravedad
tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas de un determinado
componente celular, ya sea:
Orgánulos (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, ..)
Fracciones de membrana (membrana total, plasmática, dominio basolateral,
dominio apical,...),

Complejos multiprotéicos (citoesqueleto de actina, microtúbulos, poros

nucleares, etc..),
 ETAPAS DEL FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

•Rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la
fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación.

•Separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante
algún criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o
centrifugación diferencial), la presencia de algún antígeno, etc.

Rotura de la célula Separación del componente

 Técnicas de rotura de células y tejidos
Se consigue empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente
como homogeneización. Estos métodos producen la rotura de las membranas
celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.
Los procedimientos de homogeneización más comunes son:
•Sonicación.
Sonicación Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular.
La intensa agitación producida destruye las membranas celulares.

•Uso de detergentes que solubilicen las membranas celulares.

•Filtro a presión.
presión Pasar las células a través de orificios de diámetros
reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares.

•Homogenizadores.
Homogenizadores Se trata de romper las células con la ayuda de un
émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de
un tubo de cristal especial

•Disruptores de cuchillas de alta velocidad

 CENTRIFUGACIÓN
Cuando un rotor gira en una
centrífuga, la fuerza centrífuga actúa
sobre cada una de las partículas de la
muestra. Cada partícula sedimentará
proporcionalmente a la fuerza
centrífuga aplicada.
En esto influyen:
•Las propiedades físicas de la muestra (forma, tamaño y densidad)
•La viscosidad de la solución en la que se encuentra la muestra.
Se obtiene:
•Sobrenadante,
Sobrenadante fracción homogénea que no ha sedimentado,
•Sedimento ('pellet') que ha quedado adherido al fondo del tubo.

Tipos de centrifugación:
•centrifugación preparativa,
preparativa aísla partículas específicas
•centrifugación analítica se estiman propiedades físicas hidrodinámicas de
alguna partícula
 TIPOS DE CENTRÍFUGAS

Centrífugas (de pocas g. hasta aprox. 3000 xg),

Super-Centrífugas (o centrífugas de alta

velocidad) rango de 2000 xg a 20000 xg
En estas centrífugas se suele controlar la temperatura
de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las
muestras debido a la fricción.

Ultracentrífugas (de 15000 xg a 600000xg).

En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de
100000 rpm), hace que sea necesario ademas de la
refrigeración hacer un intenso vacío en la cámara de la
centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y
muestra.
 TEORÍA BÁSICA DE LA SEDIMENTACIÓN

Algunos de los principios básicos en la teoría de la sedimentación se derivan de la Ley de Stokes.

d2 ( hP- hL)
V = ____________ x g
18 n
Donde V = velocidad de sedimentación
d = diámetro de la partícula
hP= densidad de la partícula
hL= densidad del líquido
n = viscosidad del medio
g = fuerza gravitacional
Para simplificar el problema se suele considerar que las
partículas a aislar en Biología son esferas; cuando éstas
se encuentran en un campo gravitacional y alcanzan
una velocidad constante, la fuerza neta sobre cada
esfera es igual a la fuerza de resistencia que opone el
líquido a su movimiento. En este caso particular de la
ley de Stokes se comprueba qué:

La velocidad de sedimentación de cada partícula

es proporcional a su tamaño,
es proporcional a la densidad de la partícula y a la del medio
es nula cuando ambas densidades se igualan,
disminuye al aumentar la viscosidad del medio
aumenta al aumentar el campo de fuerza.
 COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN

La velocidad de sedimentación es útil para caracterizar partículas, pero en Bioquímica se emplea

otra unidad: el coeficiente de sedimentación,
sedimentación que es la velocidad de sedimentación por unidad de
fuerza centrífuga. Es una constante característica de cada organela o macromolécula y sus
unidades se dan en SVEDVERGS, (nombre de su descubridor).

El tiempo de centrifugación hasta la clarificación de una organela se define por:

Donde: S= coeficiente de sedimentación de la organela
K K= constante del rotor. ( depende del ángulo de inclinación
T (horas) = --- del tubo de centrifugación con respecto al eje de rotación)
S
 ROTORES

Rotor de ángulo fijo.

Los tubos se insertan en orificios en el
interior de rotores macizos. El caso extremo
es el de los rotores verticales en los que el
tubo se sitúa paralelo al eje de giro. Este
tipo de rotores es típico de ultracentrífugas y
se emplea en separaciones de moléculas
en gradientes de densidad autogenerados
(por ej. de cloruro de cesio).

Rotor basculante.
Los tubos se colocan en un dispositivo
(cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en
disposición perpendicular al eje de giro. Así
pues los tubos siempre giran situados
perpendicularmente al eje de giro
 SEPARACIÓN EN CENTRIFUGACIÓN PREPARATIVA

Aplicaciones

Eliminación de células procariotas en caldos de cultivo

La centrifugación del cultivo a 10.000 x g durante 20 minutos suele ser suficiente como para crear la fuerza
centrífuga necesaria para sedimentar las células

Precipitación de proteínas con sulfato amónico

Al añadir al medio una sal, los iones de ésta neutralizan las cargas de las proteínas, llegándose a
una situación en la que, por no presentar carga neta, las proteínas floculan.

Tratamiento térmico
Las proteínas desnaturalizadas tienden a agregarse; una centrifugación diferencial
ayudará a eliminarlas por sedimentación.

Centrifugación diferencial
Técnica muy utilizada en Biología por la cual y a través de varias
centrifugaciones correlativas y crecientes se logran separar los principales
componentes celulares
CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
 CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD

Este método implica la utilización de un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde
la zona superior a la inferior. Es algo más complicado que la centrifugación
diferencial, sin embargo presenta ventajas que compensan el trabajo añadido. La
técnica permite la separación de todos, los componentes de la muestra en un solo paso,
permitiendo además realizar medidas analíticas.

Centrifugación zonal
La muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado.
Bajo fuerza centrífuga las partículas comenzarán a sedimentar a través del gradiente, moviéndose
cada partícula a diferentes velocidades dependiendo de su masa.

Centrifugación isopícnica
La muestra se disuelve en una solución isocrática; sometida ésta a fuerza centrífuga, el
soluto formador del gradiente se distribuye en el tubo de centrífuga, a la vez que cada
partícula se reorienta hacia la zona que le corresponde por densidad.

Ambas técnicas utilizan solutos que forman un gradiente

 Sacarosa.
Disacárido ampliamente empleado en la separación y purificación de materiales biológicos mediante
centrifugación zonal. Presenta una alta viscosidad, lo que no le permite alcanzar grandes densidades. Se utiliza
en el estudio de proteínas.

Ficoll.
Polisacárido sintético de alto peso molecular (400 kDa). Con alto contenido en grupos hidroxilo (buena
solubilidad en medios acuosos). Puede ser autoclavado sin degradarse. Su viscosidad es menor que la de la
sacarosa y no altera la presión osmótica del medio.

Percoll.
Sol de silica revestido de un derivado de polivinilo que presenta baja viscosidad a densidades altas, no afecta
prácticamente a la presión osmótica del medio y es estable a pH comprendidos entre 5 y 10. Es soluble en
soluciones acuosas y estable en ellas siempre que no haya aniones bivalentes (sulfato), especialmente a bajos
pH.. El compuesto puede ser utilizado para centrifugaciones zonales, preformando gradientes, o bien para
centrifugación isopícnica, ya que la centrifugación de percoll en rotores angulares durante 20-30 minutos y
20.000-100.000 x g produce un ligero gradiente, independientemente de la densidad inicial .

Cloruro de cesio.
Sal que rinde altas densidades manteniendo la viscosidad del medio adecuada. Es un soluto de baja masa
molecular, sin embargo presenta un gran poder osmótico, por lo que nunca se emplea para la separación de
proteínas. Se emplea muchísimo en la separación de ácidos nucleicos mediante centrifugación isopícnica. La
utilización de CsCl requiere el empleo de materiales resistentes, ya que se trata de una sal muy corrosiva, por lo
que en su manejo se emplean rotores de titanio, mas inertes que los de aluminio.
 Centrifugación por velocidad de sedimentación
(centrifugación zonal)
La fórmula relaciona el coeficiente de sedimentación, s, con el radio de
la molécula r (o partícula, en general), su densidad d, y la densidad do y
viscosidad η del medio.
 Gradiente de densidad

muestra

gradiente
 Recolección de los gradientes
Una vez que se han separado una serie de especies
moleculares u organelas en un gradiente de densidad,
es importante recuperar los componentes separados.
El modo de recolección depende
•Del tipo de tubo usado para el gradiente,
• De la distribución de las partículas en el gradiente y
•Del objetivo del fraccionamiento.
Estos métodos permiten que los contenidos en los tubos
de centrifuga salgan secuencialmente a una serie de
tubos de ensayo

Con los contenidos de tubo de centrifuga

distribuidos en una serie de tubos de
ensayo individuales, es posible averiguar la
distribución de los componentes que se
deseen.
Confirmación de la eficiencia del método
En el caso de organelas celulares esto se puede
hacer mediante:
• La localización de las actividades enzimáticas del "marcador"
específico

• Verificando la morfología mediante microscopía

electrónica

Las organelas y moléculas que carezcan de

actividades enzimáticas fácilmente ensayables se
localizan bien por
• Su absorción de luz o
• Marcaje radiactivo
 La mayoría de los estudios sobre la
fisiología celular requieren para su análisis
el aislamiento del componente celular a ser
analizado

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

En Biología Celular existen un conjunto de métodos y técnicas que

basándose en la ley de la gravedad tienen como objetivo obtener fracciones
puras o enriquecidas de un determinado componente celular.
Permite caracterizar
moléculas por tamaño y carga.

Ej. Proteínas, Ácidos

Nucleicos
Electroforesis en SDS gel
electroforesis (SDS- PAGE).
(A) Aparato de electroforesis
Electroforesis de marcadores y de
sobrenadantes de sapo y rata

205kDa

116kDa
97kDa

66kDa

tubulina

45kDa

29kDa

sapo rata
 Electroforesis en gel de poliacrilamida en dos dimensiones.
Todas las proteínas en una célula bacterial (E. Coli) son separadas en un gel en 2-D, en el
cual cada mancha corresponde a diferentes cadenas de polipeptidos.
Las proteínas fueron son separadas de acuerdo a su punto isoelectrico por
isoelectroenfoque, de izquierda a derecha. Ellas fueron luego fraccionadas de acuerdo a su
PM, por electroforesis desde el tope al fondo en la presencia de SDS. Note que diferentes
proteínas están presentes en cantidades muy diferentes . Las bacterias fueron alimentadas
con una mezcla de aminoácidos radioactivos tal que todas sus proteínas estaban
radioactivas y pudieron ser detectadas por autoradiografia (Courtesy of Patrick O'Farrell.)
 ESPECTROFOTÓMETRO DE FLUORESCENCIA

• Excelente Sensibilidad
• Relación señal y ruido de 300 o mayor
• El diseño óptico provee sensibilidad
excepcional
• Es un instrumento compacto.
• El sistema óptico brillante y filtro digital
de supresión de ruido hace posible la
medición de alta sensibilidad.
• La velocidad de barrido es posible de
seleccionar en 4 etapas
• Rotación de longitud de onda es posible
en velocidades ultra rápidas logrando
30.000nm/min.
 ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA
CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS:
- Rango de longitud de onda: 190 a 860 nm
- Paso de banda espectral: 0,2 nm a 200 nm
- Dispersión lineal recíproca:
. a 200 nm - 0,1 nm/mm
. a 800 nm - 0,4 nm/mm
Con su particular combinación de sensibilidad,
especificidad, precisión y bajo costo, la absorción
atómica hace posible la determinación de
alrededor de 70 elementos en una amplia variedad
de materiales biológicos, geológicos y productos
metalúrgicos e industriales en general
Componentes del sistema:
- Unidad espectrométrica que contiene las ópticas,
incluyendo lámparas y policromador.
- Horno de grafito
. Unidad extractora de humo
. Muestreador automático en el horno
- FIMS Sistema de inyección de flujo de mercurio
- Sistema de enfriamiento del horno
- Ordenador con software asociado (AA win Lab)
- Impresora
- Atomización: calentamiento transversal del horno de grafito, calentamiento eléctrico
- Rango de medidas de:
•. Absorbancia -0,5 a 2000
•. Concentración 0,0001 a 9999 unidades de concentración
•. Tiempo de lectura 1 a 60 segundos
•. Tiempo de demora 0 a 60 segundos
 RESUMEN DE MÉTODOS

 Microscopía
• Microscopía Óptica
• Microscopía Electrónica
 M. E. de Transmisión
 M. E. de Barrido
 Sub-Fraccionamiento Celular
 Electroforesis
 Espectrofotometría
 Atómica
 Fluorescente