Tinciones Diferenciales

Prcticas de Laboratorio II
Dr. Jos Magarios Tc. Luciano Rey Tc. Beln Manrique

Tinciones diferenciales
Como su nombre lo indica, nos permiten diferenciar entre grupos de bacterias que tienen distintas propiedades tintoriales
Las tinciones diferenciales ms comnmente utilizadas son la tincin de Gram y la tincin de Ziehl-Neelsen

Tincin de Gram
La tincin de Gram. Fue desarrollada empricamente por Christian Gram en 1884, a pesar del tiempo transcurrido la tincin apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificacin bacteriana. La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas y Gram negativas.

Fundamento de la Tcnica
La diferenciacin entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se establece en la naturaleza y caractersticas de la pared celular bacteriana.
Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano que es capaz de retener al complejo colorantemordiente (cristal violeta-yodo). Durante la decoloracin con alcohol acetona se provoca una deshidratacin de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces al complejo en el interior de la clula.

Las bacterias Gram negativas, poseen una delgada capa de peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo colorantemordiente (cristal violeta-yodo) y es entonces fcilmente teida por el colorante secundario o de contraste.

Resultados de la coloracin
Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente se refiere difieren en el color con el que finalmente se tien las bacterias. Gram positivas se observarn de azul por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perdern la coloracin inicial con los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la Safranina.

La diferencia esta determinada por la composicin de su envoltura celular, las bacterias Gram. positivas poseen una malla de pptido glicano en su parte mas externa ,mientras que las Gram. negativas recubriendo una fina capa de peptidoglicano y presentan una membrana externa .

Reactivos y Colorantes
La tincin de Gram. requiere cuatro soluciones: 1. Primer colorante. Un colorante bsico (+) que en contacto con las clulas cargadas negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El mas utilizado es el cristal violeta. 2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. Los mordientes usados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como por ejemplo, una sol. diluida de yodo. 3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico; por ejemplo alcohol acetona (1:1). 4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como por ejemplo, la Safranina.

Procedimiento Tcnico
1) 2) Realizar el extendido de la muestra Fijacin del extendido
Mtodos fsicos: accin del calor Mtodos qumicos: metanol

3) 4) 5) 6)

Primer colorante: cristal violeta Mordiente: Lugol (sc I2/KI) Decoloracin: mezcla alcohol-acetona 1:1 Segundo colorante: safranina

Procedimiento Tcnico

Diferencias entre Gram (+) y (-)

Morfologa Bacteriana

Tincin de Ziehl-Neelsen
La tincin de Ziehl_Neelsen desarrollada inicalmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de tuberculosois en muestras clnicas de pacientes es otra muy importante tincin diferencial.
La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: BAAR positivas y BAAR negativas.

BAAR: bacilos cido alcohol resistentes

Fundamento de la Tcnica
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias. contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de lo cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y la que no se ven de color azul.

Procedimiento Tcnico
1) 2) 3) 4) Hacer un frotis Secar al aire y fijar por calor Cubrir todo el porta-objetos con fucsina fenicada Calentar suavemente con el mechero hasta la emisin de vapores. 5) El colorante no debe secarse ni hervir, aadir ms si es necesario. 6) Mantener la emisin de vapores durante 5 minutos. 7) Lavar con un chorro suave de agua. 8) Decolorar con alcohol cido 9) Lavar con agua 10) Cubrir el frotis con azul de metileno y dejarlo actuar durante un minuto. 11) Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire Observar al microscopio con el objetivo de inmersin Las bacterias ZN+ o BAAR se observarn teidas intensamente de color rojo.

Mycobacterium tuberculosis

Tinciones Selectivas
Las tinciones selectivas nos permiten observar estructuras de las clulas gracias a su mayor afinidad por los colorantes utilizados

Se pueden observar estructuras como la pared celular, cpsula, flagelos, material nuclear, e inclusiones como depsitos de materiales de reserva de poli--hidroxibutirato, glucgeno y grnulos metacromticos

Coloracin de esporas
Algunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecacin, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y vuelven a generarse formas vegetativas. Por ese motivo, las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que cuando se hace una tincin, se observan al microscopio como cuerpos altamente refringentes y sin teir. Sin embargo, las endosporas se pueden teir aplicando calor a la preparacin previamente cubierta con una solucin de colorante que en la tcnica de Shaeffer y Fulton es el verde de malaquita. El lavado con agua elimina este colorante de las clulas vegetativas y la aplicacin de un colorante de contraste permitir distinguir claramente a las esporas de color verde.

Endosporas en las bacterias

Coloracin de la cpsula
Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cpsula. Est compuesta de azcares y protenas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cpsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de cpsula dificulta de algn modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cpsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos. La tincin de cpsula se denomina tincin negativa porque tie el fondo de la preparacin y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tincin propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece ms a una preparacin en fresco. Su realizacin es sencillsima, consiste en colocar la muestra hmeda sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta cubre toda la preparacin a excepcin de las cpsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con cpsula sin color.

Procedimiento Tcnico
Mtodo de la tinta china para cpsula
1.-En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra de tinta china y un poco del cultivo de una cepa capsulada. Se mezcla suavemente sin extender. 2.-Se coloca un cubreobjetos sobre la suspensin y se presiona suavemente evitando que queden burbujas. 3.-Observar inmediatamente al microscopio. 4.-Desechar la preparacin en un recipiente con antisptico. La cpsula se observa como una gran estructura alrededor de la clula delimitada por los pequeos fragmentos de carbn de la tinta china.

Cpsulas bacterianas