MINISTERE DE LENSEIGMENT SUPERIER ET LA RECHERCHESCIENTIFIQUE

UNIVERSITE IBN KHALDOUN –TIARET-

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
DOMAINE SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

EXPOSE SUR
Construction de poxvirus comme vecteurs de clonage :
Insertion du gène de thymidine kinase du virus de herpès
simplex dans le ADN du virus de la vaccine infectieux

PRESENTE PAR
•Belkessa Wissam
•Beneche souhila
•Boudjelal Moubarek
•Daddi addoun Amina
 Plan de travail
 Introduction
 Matériel et méthode
La construction de vecteurs plasmatiques
 La construction, le dépistage et la récupération des virus
recombinants du vaccinia
ADN Restriction , analyser le ADN du virus vaccinal recombinant
 Analyse des transcrits d'ARN
 Résultats
La construction et la récupération de virus recombinants contenant
le gène HSV TK
Analyse de restriction des virions de vaccinia recombinants modifiés
par l'insertion du gène HSV TK
Analyse de la transcription
 Résultats
 Discussion
 Conclusion
 Introduction
L'introduction de séquences d'ADN étranger dans les
cellules eucaryotes est un domaine de recherche en
constante évolution, avec plusieurs méthodes
actuellement sous investigation Récemment, une
avancée significative a été réalisée en démontrant que
des éléments sousgénomiques endogènes peuvent être
insérés dans les progénitures infectieuses du virus
vaccinia par recombinaison in vivo.
Dans cette étude, nous avons choisi le gène de la
thymidine kinase (TK) du virus herpès simplex (HSV)
comme modèle. Ce gène est bien caractérisé et son
séquençage est connu, ce qui en fait un choix idéal
pour évaluer la faisabilité de l'insertion de gènes
étrangers dans le virus vaccinia.
 Matériel et méthode
les types de cellules et les virus utilisés dans une étude
ou une expérience. Voici une explication détaillée :
1 .Cellules humaines TK- (ligne 143) : Ces cellules sont
des cellules humaines ayant une déficience en
thymidine kinase (TK-), un enzyme impliqué dans la
biosynthèse de l'ADN
2. Cellules de rein de singe vert africain (CV-1) : Ces
cellules sont dérivées de reins de singes verts africains.
Elles sont maintenues en culture sous forme de
monocouche dans un milieu modifié d'Aigle
contenant 10 % de sérum de veau fœtal
3. Cellules de rein de hamster nouveau-né (BHK-
21) : Ces cellules sont dérivées de reins de hamsters
nouveau-nés.
4. Variantes L et S du virus de la variole (vaccinia
virus) : Il s'agit de différentes souches du virus de la
variole.
5 . VTK-A1, un mutant TK- contenant le génome de
la variante L : Ce mutant du virus de la variole, qui
présente une déficience en thymidine kinase (TK-),.
6. VTK-79, un mutant TK- contenant le génome de la
variante S : Ce mutant du virus de la variole,
également déficient en thymidine kinase (TK-), a été
dérivé dans le laboratoire des chercheurs mentionnés
dans le passage
La construction de vecteurs plasmidiques
Matériaux de départ : On commence avec trois éléments
clés :
Le plasmide pBR322, qui contient déjà un fragment de
l’ADN du virus Herpes Simplex (HSV) avec le gène de la
thymidine kinase (TK) inséré par le site de restriction
BamHI.
Un fragment d’ADN du virus de la variole, coupé par
l’enzyme de restriction HindIII, nommé fragment HindIII
F.
Des cellules bactériennes Escherichia coli de la souche
HB101
Ligation : On lie le fragment HindIII F avec le plasmide
pBR322 qui a été coupé par HindIII, en utilisant une
ligase d’ADN T4 de phage. Cela se fait dans un tampon
de réaction spécifique et la réaction est laissée pendant
la nuit à 10°C.
Transformation : Les cellules E. coli HB101 sont ensuite
transformées avec l’ADN ligaturé, ce qui signifie qu’elles
prennent cet ADN et l’intègrent dans leur propre
matériel génétique.
Détection des recombinants : On sélectionne les
bactéries transformées qui sont résistantes à
l’ampicilline mais sensibles à la tétracycline, ce qui
indique que le plasmide recombinant est présent. Ces
bactéries sont ensuite analysées pour confirmer la
présence du fragment HindIII F.
Isolation du plasmide recombinant : Le plasmide
recombinant contenant le fragment HindIII F est isolé et
nommé pDP3.
Quantités préparatives d’ADN de pDP3 : On produit de
grandes quantités d’ADN de pDP3 en utilisant une
procédure de lysat clarifié et en amplifiant avec du
chloramphénicol.
Insertion du fragment BamHI TK dans pDP3 : L’ADN de
pDP3 est d’abord linéarisé par une digestion partielle
avec BamHI, puis ligaturé avec le fragment BamHI TK
purifié.
Détection des inserts TK : Enfin, on vérifie la présence
des inserts TK dans les cellules E. coli HB101
transformées en utilisant une technique d’hybridation de
colonies.
 La construction, le dépistage et la récupération des
virus recombinants du vaccinia :
Insertion du gène HSV TK dans le vaccinia virus :
De l’ADN de plasmide (pDP132 ou pDP137) clivé par
HindIII est mélangé avec de l’ADN du vaccinia virus et
précipité avec de l’orthophosphate de calcium.
Ce mélange est ensuite ajouté à des cellules BHK-21 ou CV-
1 qui ont été infectées par le vaccinia virus.
Après 24 heures, les cellules sont récoltées et lysées par des
cycles de congélation-décongélation pour libérer les virus,
qui sont ensuite dépistés pour identifier les virus
recombinants.
Approches de dépistage et d’isolement des virus
recombinants :
Les cellules infectées sont imprégnées sur des filtres de
nitrocellulose, et les plaques virales contenant l’insertion
HSV TK sont détectées par hybridation in situ après
coloration au rouge neutre.
Les virus recombinants exprimant l’activité HSV TK sont
sélectionnés sur des cellules humaines TK- en présence de
méthotrexate.
La présence d’une TK fonctionnelle dans les virus
recombinants est détectée par la phosphorylation de
l’[I]iododéoxycytidine.
Récupération des virus recombinants :
Les virus recombinants exprimant la TK HSV sont
récupérés à partir des zones des filtres de
nitrocellulose où les plaques ont été localisées par
radioautographie.
Ces virus sont ensuite purifiés par deux cycles
d’isolement de plaque pour obtenir des préparations
pures de virus recombinants.
Ce processus permet de créer des virus recombinants
qui contiennent un gène étranger, ici le gène TK de
l’HSV, qui peut être utilisé pour des études de fonction
génique ou pour le développement de vaccins.
ADN Restriction , analyser le ADN du virus
vaccinal recombinant
1. Extraction de l'ADN : L'ADN du virus vaccinal
recombinant infectant des monocouches de cellules CV-1
est extrait selon des protocoles spécifiques.
2. Digestion enzymatique : L'ADN extrait est ensuite
digéré à l'aide d'enzymes de restriction telles que HindIII,
BamHI ou SstI. Ces enzymes coupent l'ADN à des sites
spécifiques, générant des fragments d'ADN de tailles
différentes.
3. Analyse sur gel d'agarose : Les fragments d'ADN digérés
sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose.
4. Transfert sur nitrocellulose :. Ce transfert permet de
fixer les fragments d'ADN à la membrane, les maintenant
dans leur position relative par rapport au gel.
5. Hybridation avec une sonde marquée : La membrane
de nitrocellulose est ensuite hybridée avec une sonde
d'ADN spécifique marquée avec 32P. Cette sonde est
généralement un fragment d'ADN complémentaire à une
séquence spécifique du gène HSV TK.
6. Détection des hybridations : Les hybridations entre la
sonde marquée et les fragments d'ADN spécifiques sont
détectées à l'aide d'une autoradiographie. Cela permet de
visualiser les fragments d'ADN contenant la séquence
spécifique du gène HSV TK.
 Analyse des transcrits d'ARN
1. Synthèse in vitro de l'ARN du virus vaccinal
recombinant, marqué avec [α-32P]GTP pour une
détection radiographique.
2. Sélection de l'ARN par hybridation avec de l'ADN
spécifique lié à du papier spécial.
3. Hybridation de l'ARN sélectionné avec des fragments
d'ADN spécifiques du plasmide pDP137, préalablement
digérés par des enzymes de restriction (SstI ou
HindIII/BamHI), sur des blots Southern.
 Résultats
La nature non infectieuse de l'ADN purifié du vaccinia virus,
son site de réplication cytoplasmique et son génome large
posent des problèmes uniques aux approches de
manipulation génétique du virus
• L'insertion d'ADN étranger dans les progénitures
infectieuses du vaccinia virus implique la formation
d'ADN recombinant contenant le gène étranger flanqué de
séquences génomiques du vaccinia virus.
 • Cet ADN chimérique est introduit dans les cellules
hôtes sous forme de précipité de phosphate de calcium,
puis les cellules sont infectées par le vaccinia virus.
• Une recombinaison in vivo se produit entre les
séquences d'ADN flanquantes du vaccinia virus et les
séquences homologues présentes dans le génome du
vaccinia virus en réplication.
• L'ADN recombiné, contenant l'insert génétique
étranger, se réplique et est ensuite empaqueté dans le
virus infectieux.
 la construction de vecteurs
plasmidiques chimériques
utilisés pour l'expression de gènes étrangers dans le virus
de la vaccine. L'objectif est de développer une méthode
permettant d'insérer des gènes étrangers de manière
spécifique sans perturber les fonctions essentielles des
gènes du virus hôte.
Méthodologie :
-Identification d'un site BamHI situé dans le fragment
interne HindIII F du virus de la vaccine, compatible avec
l'insertion de gènes étrangers.
-Construction des plasmides d'ADN recombinant en
ligaturant le plasmide pBR322 digéré par HindIII avec un
fragment HindIII F du virus de la vaccine.
-Insertion du fragment BamHI TK du virus HSV (herpès
simplex) dans les plasmides, permettant ainsi
l'expression du gène étranger.
-Identification des plasmides contenant l'insert HSV TK
par hybridation de colonies avec une sonde d'ADN HSV
TK traduite.
Résultats :
-Deux plasmides, pDP132 et pDP137, ont été
sélectionnés pour des études complémentaires.
-L'analyse de restriction a révélé que l'insertion du HSV
TK dans pDP132 était dans une orientation opposée par
rapport à pDP137.
-Deux copies du gène TK étaient présentes dans pDP137
sous forme d'un tandem "tête-bêche
 La construction et la récupération de virus
recombinants contenant le gène HSV TK
Lors de la construction et de la récupération de virus
recombinants contenant le gène HSV TK, plusieurs
approches ont été employées pour introduire avec succès
ce gène dans le génome du virus vaccinia des
populations de virus vaccinia recombinants, vPl-6,
contenant le gène HSV TK ont été construites et
analysées. La stratégie de recombinaison in vivo a été
utilisée, impliquant l'utilisation d'ADN donneur sous
forme de précipité de phosphate de calcium de
plasmides pDP132 ou pDP137 et d'ADN de vaccinia virus
variant S purifié comme porteur, avec du virus vaccinia
variant S infectieux comme receveur
. Deux approches ont été utilisées pour la détection des
virus recombinants contenant l'insert HSV TK.
La première impliquait le dépistage sur des filtres de
nitrocellulose en replica, où environ 0,4% des plaques
générées à partir de la progéniture de la recombinaison in
vivo ont été détectées comme contenant l'insert HSV TK,
confirmé par hybridation in situ.
La seconde approche reposait sur l'utilisation de
l'iododéoxycytidine marquée au 125I pour détecter la
présence de l'activité HSV TK, révélant que seul le virus
recombinant vP2 exprimait le gène HSV TK.
Deux autres virus recombinants contenant l'insert HSV TK
ont été dérivés par recombinaison in vivo dans des
monocouches de BHK. Les deux recombinants ont été
identifiés par hybridation in situ et des filtres de
nitrocellulose
La FIG. 2 représente un test d'iododéoxycytidine marquée au 125I pour
l'expression de HSV TK dans le virus vaccinia recombinant. Des
monocouches de cellules CV-1 non infectées ou infectées pendant 48
heures ont été incubées avec 1,5 ml de milieu de recouvrement liquide
contenant 5 ACi d'iododéoxycytidine marquée au 125I pendant 16
heures. Elles ont ensuite été lavées trois fois avec du tampon de
phosphate saliné, et les monocouches colorées au rouge neutre ont été
imprimées sur des filtres de nitrocellulose. Un autoradiogramme des
monocouches de cellules non infectées (A), infectées par le virus
vaccinia variant S (B), infectées par le virus vaccinia recombinant vPl (C)
et infectées par le virus vaccinia recombinant vP2 (D) est présenté.
 Analyse de restriction des virions de vaccinia
recombinants modifiés par l'insertion du gène HSV
TK
• Extraction de l'ADN :
• L'ADN a été extrait des variants S et des virus vaccinia
recombinants vPl et vP2, puis digéré avec HindIII, BamHI
ou Sst I.
• L'analyse a été réalisée sur des gels d'agarose.
• Résultats de l'analyse de restriction :
• La digestion par HindIII des vP1 (voie 2) et vP2 (voie 3) a
généré un nouveau fragment de 10,9 MDal, non trouvé
dans le variant S (voie 1).
 • La digestion par BamHI a généré un fragment
supplémentaire de 2,3 MDal dans vP1 (voie 5) et vP2
(voie 6), absent dans le variant S (voie 4).
• La digestion par Sst I a donné de nouveaux fragments
dans vPl (voie 8) et vP2 (voie 9), confirmant l'insertion
du gène HSV TK dans le fragment HindIII F dans une
orientation opposée.
• La sonde d'ADN nick-traduite 32P-labélisée a hybridé
aux fragments contenant le gène HSV TK dans vPl et
vP2 (voie 2, 3, 5, 6, 8, et 9), mais pas dans le variant S
(voie 1, 4, 7).
FIG. 3. Analyse de restriction des virus vaccinia recombinants.
Les ADN des variants S et des virus vaccinia recombinants
vPl et vP2 ont été digérés avec HindIII, BamHI ou Sst I et
analysés sur un gel d'agarose. (A) Digestion par HindIII du
variant S (voie 1), de vPl (voie 2) et de vP2 (voie 3) ; digestion
par BamHI du variant S (voie 4), de vP1 (voie 5) et de vP2
(voie 6) ; digestion par Sst I du variant S (voie 7), de vPl (voie
8) et de vP2 (voie 9). (B) Radioautographie du Southern blot
sur lequel l'ADN nick-traduit 32P-labélisé de HSV TK (1 x 105
cpm/ml) a été hybridé. L'hybridation avec le fragment
HindIII de 10,9 MDal dérivé de vP1 (voie 2) et vP2 (voie 3), le
fragment BamHI de 2,3 MDal dérivé de vP1 (voie 5) et vP2
(voie 6), et les fragments de 17,0 et 3,4 MDal dérivés de vP1
(voie 8) et les fragments de 17,7 et 2,7 MDal dérivés de vP2
(voie 9) par digestion Sst I sont indiquées. Aucune
hybridation à l'ADN variant S restreint (voies 1, 4 et 7) n'a été
 Analyse de la transcription
Étude visant à déterminer si le vaccinia virus reconnaît et
transcrit efficacement les signaux régulateurs du gène HSV
TK.
Méthode : • Utilisation du virus vaccinia recombinant vP2
exprimant l'activité du gène HSV TK.
 Synthèse in vitro de l'ARN marqué au 32P à partir du virus
vP2 purifié.
 Sélection de l'ARN marqué par hybridation avec le gène TK
de HSV cloné.
 Hybridation de l'ARN sélectionné à une plaque Southern de
l'ADN pDP137 digéré par des endonucléases de restriction.
 Comparaison des résultats avec de l'ARN marqué in vivo à
différentes étapes après l'infection
 Résultats
• Hybridation spécifique de l'ARN sélectionné avec le
fragment HindIII/BamHI de 2,3 MDal du gène TK de HSV.
• Confirmation de la reconnaissance et de la transcription
efficace des signaux régulateurs du gène TK de HSV par le
vaccinia virus.
 • Fiabilité de la transcription du gène TK de HSV par le
vaccinia virus démontrée à différentes étapes après
l'infection.
FIG. 4. Analyse de la transcription du gène HSV TK dans le
virus vaccinia recombinant vP2. (A) Gel d'agarose de l'ADN
pDP137 digéré par Sst I (voie 1) ou HindIII/BamHI (voie 2).
(B) Radioautographie de l'hybridation de l'ARN 32P-
sélectionné synthétisé in vitro en utilisant le virus vaccinia
recombinant vP2
 Discussion
Nous avons montré qu'il est possible d'utiliser les poxvirus,
comme le virus vaccinia, comme vecteurs génétiques en
insérant un gène appelé HSV TK dans leur génome. Nous
avons créé six versions différentes du virus vaccinia, chacune
contenant ce gène HSV TK. Nous avons constaté que dans
certaines versions, le gène HSV TK était actif, tandis que
dans d'autres, il ne l'était pas. Il semble que l'orientation
correcte du gène dans le virus soit importante pour son
activité.
Nous avons également constaté que nous pouvions insérer
d'autres morceaux d'ADN étranger dans le virus vaccinia
sans problème majeur, ce qui ouvre de nombreuses
possibilités pour la création de vaccins ou d'autres
traitements médicaux
 Conclusion
cette étude démontre que les poxvirus, comme le virus
vaccinia, peuvent servir efficacement de vecteurs
génétiques pour transporter des gènes étrangers tels que
le gène HSV TK. Cette approche ouvre de nouvelles
perspectives dans le domaine de la recherche médicale
et de la production de vaccins, offrant des opportunités
pour le développement de thérapies géniques et la lutte
contre diverses maladies.