La differenza di cammino della

radiazione diffratta nella direzione θ

al rilevatore, da due oggetti separati dalla
lungo la direzione 
distanza d è d sin(θ)
direzione del fascio
non diffratto Quando d sin(θ) = n λ, un numero
intero di lunghezze d’onda, si ha
 interferenza costruttiva.
d
Poiché sin(θ) è sempre minore di 1,
segue che se λ > d non si ha mai
interferenza costruttiva. Per questo
onda piana
lunghezza d'onda  la cristallografia di proteine utilizza i
raggi X come radiazione.
 Cristallografia
Se si pensa a come determinare la forma di un oggetto, la risposta più ovvia è di osservarlo.
Se l’oggetto è piccolo, usiamo un microscopio. Però c’è un limite a quanto piccolo un oggetto può essere per essere visibile col
microscopio ottico. Questo limite (il limite di diffrazione) è dovuto al fatto che non si può creare un’immagine di un oggetto più
piccolo della lunghezza d’onda della radiazione che stiamo usando. La lunghezza d’onda della luce visibile si misura in centinaia di
nm, mentre gli atomi sono separati da distanze dell’ordine di 0.1 nm.
I raggi X hanno la corretta lunghezza d’onda per osservare gli oggetti su questa scala dimensionale.
Però, non è possibile costruire un microscopio a raggi X per osservare le molecole. Infatti non esistono lenti per raggi X, e anche se
esistessero dovrebbero essere lavorate con una precisione pari alla scala delle distanze tra due atomi.
Comunque, possiamo in qualche modo simulare una lente a raggi X con l’aiuto della matematica e del calcolatore. Infatti si può
pensare al modo di lavorare di un microscopio essenzialmente come due passaggi: 1. La luce colpisce l’oggetto e ne è diffratta in
varie dimensioni, dipendendo da come è fatto l’oggetto. 2. La lente raccoglie la luce diffratta e la riassembla per costruire l’immagine
Lavorando con i raggi X è possibile raccogliere la radiazione diffratta, tramite un rivelatore, ma per riassemblare l’immagine abbiamo
bisogno della matematica e di un calcolatore.

Non è semplice, ma è questa l’essenza del metodo.

 Principio della cristallografia a raggi X
Perché i raggi X?
L’uso della radiazione elettromagnetica per visualizzare un oggetto richiede una lunghezza d’onda della stessa scala dei particolari
che si vogliono osservare. I raggi X emessi da bersagli di rame bombardati con elettroni ad alta energia hanno diverse lunghezze
d’onda caratteristiche. In particolare viene usata l’emissione detta CuKα con λ=0.154 nm, paragonabile alla distanza tra atomi di
carbonio legati e quindi adatta allo studio delle strutture proteiche.

Perché la densità elettronica?

Il risultato di un esperimento di cristallografia non è una vera immagine degli atomi, ma piuttosto una mappa della distribuzione di
elettroni nella molecola, cioè una mappa di densità elettronica. Infatti la radiazione elettromagnetica, come luce visibile e raggi X,
interagisce con la materia attraverso campi elettrici oscillanti che possono accelerare particelle cariche. La particella accelerata
diventa a sua volta emettitrice di radiazione. Siccome gli elettroni sono circa 2000 volte più leggeri dei protoni, vengono accelerati
in maggior misura e quindi sono più efficaci nel diffondere la radiazione.
Comunque, siccome gli elettroni sono per lo più strettamente localizzati attorno ai nuclei, la mappa di densità elettronica ci dà
un’immagine della molecola piuttosto buona.

Perché un cristallo?
Una singola molecola diffrange un numero troppo basso di raggi X per potere essere rivelati oltre il livello di rumore, che include
diffrazione da acqua e aria. Un cristallo invece comprende un enorme numero di molecole con la stessa orientazione, così che le
onde diffratte si sommano in fase e danno luogo a un segnale che emerge dal rumore. Il cristallo agisce quindi come un
amplificatore.
Le onde diffratte si sommano in fase in alcune direzioni e fuori fase, cancellandosi, in altre direzioni. Questa è la ragione perché un
diagramma di diffrazione è composto da piccole zone luminose isolate.
Il cristallo produce un diagramma di diffrazione che porta l’informazione
su come è fatto il cristallo (la posizione delle riflessioni) e sulla struttura
della proteina (l’intensità delle riflessioni)

Cristallo di proteine immagine di diffrazione ricostruzione della struttura

della proteina
 Legge di Bragg: 2dsin(θ)=nλ

Fascio diffratto
Fascio incidente



d

Cristallo

Fascio trasmesso
La trasformata di Fourier di due punti produce una griglia.

Otto punti in schiera rappresentano un cristallo microscopico. Poiché il cristallo è piccolo, le riflessioni sono estese.
Quindici punti in schiera rappresentano un cristallo di dimensioni maggiori. Il reticolo nello spazio reciproco è adesso più definito

Una singola molecola e il suo diagramma di diffrazione

Due molecole e il relativo diagramma di diffrazione

Otto molecole e il relativo diagramma di diffrazione

Quindici molecole e il relativo diagramma di diffrazione

Le strutture rappresentate dalle molecole sistemate a schiera, come in un cristallo,

si dicono che sono la convoluzione della molecola con una schiera costituita da
punti. La trasformata di Fourier della convoluzione è il prodotto delle trasformate di
Fourier della molecola e della schiera di punti.

La posizione delle riflessioni porta l’informazione sulla struttura del cristallo.

La modulazione delle loro intensità porta l’informazione sulla struttura della
molecola.
 Diffrazione
Si pensi agli elettroni in un cristallo come a emettitori di onda. Quando le onde si sommano interferiscon le une con le altre, possono
sommarsi in fase o fuori fase, o in maniera intermedia. Come si sommano dipende dalla direzione delle onde incidenti ed emergenti
e dalle posizioni relative degli elettroni. Il cammino totale dell’onda, dalla sorgente al rivelatore, determina cosa succede.
Se la differenza di lunghezza tra il passare per la posizione di un elettrone o un altro è un multiplo intero di lunghezza d’onda allora
le onde si sommano in fase. Se la differenza di cammino è un semimultiplo della lunghezza d’onda, allora le onde si cancellano
reciprocamente.
Nel cristallo, la condizione perché le onde siano diffratte in fase è descritta dalla legge di Bragg, che lega lunghezza d’onda, spazio
interplanare e angolo di diffrazione.
Si nota dalla legge di Bragg che data la lunghezza d’onda, se la distanza interplanare diminuisce allora il primo picco dell’intensità
diffratta cade ad angoli di diffrazione maggiori. A causa di questa relazione inversa tra distanza interplanare e angolo di diffrazione,
si parla di “spazio reciproco” per indicare il luogo dove cadono i picchi di diffrazione. Più ci si allontana dal centro del diagramma di
diffrazione, più informazione si raccoglie da oggetti che sono più vicini nello “spazio reale”.

Teoria di Fourier
Il diagramma di diffrazione è correlato all’oggetto che diffrange la radiazione attraverso una operazione matematica detta
Trasformata di Fourier (T.F.). Se si pensa a una funzione matematica che descrive la densità elettronica allora il campo elettrico
diffratto è descritto dalla T.F. di quella funzione.
La T.F. può essere invertita e dare come risultato la funzione originale, cioè la descrizione dell’oggetto, la sua densità elettronica.
C’è però il problema che ciò che il rivelatore può osservare non è il campo elettrico, cioè la T.F. dell’oggetto, ma la sua intensità,
cioè l’ampiezza al quadrato della T.F. Questo è detto il “problema della fase”
Infatti per calcolare l’inverso della T.F. dobbiamo conoscere sia l’ampiezza che la fase della T.F., ma il rivelatore può solo contare il
numero di fotoni diffratti. Non abbiamo modo di conoscere le fasi relative dei vari picchi di intensità diffratta.