Restriction Enzyme 

Digestion
Timothy G. Standish, Ph. D.

©2000 Timothy G. Standish

 Enzymes are the Tools of 
DNA Technology
● The tools of DNA technology are the same enzymes 
used by cells to modify their own DNA:
– DNA Polymerases
– DNA Ligase
● One special class of enzyme is pivotal to the cloning of 
DNA and many other techniques used in DNA 
Technology
● These enzymes are the restriction endonucleases
– Restriction ­ Because for the way they work, they restrict 
bacteriophages to only one host bacterial strain.  They are also 
restricted to acting on only specific DNA sequences
– Endonuclease ­ They cut nucleic acids in the middle not just 
the ends ©2000 Timothy G. Standish
 Restriction Endonucleases
● There are a number of different sub classes of 
restriction endonucleases
– Type I ­ Recognize specific sequences and cut DNA 
at a nonspecific site > than 1,000 bp away
– Type II ­ Recognize palindromic sequences and cut 
within the palindrome
– Type III ­ Recognize specific 5­7 bp sequences and 
cut 24­27 bp down stream of the site.
● Type II restriction endonucleases are the most 
useful class as they recognize specific palindomic 
sequences in DNA and cut the sugar phosphate 
backbone within the palindrome ©2000 Timothy G. Standish
 What is a Palindrome?
● A palindrome is anything that reads the same 
forwards and backwards:
● English palindromes:
● Mom
● Dad
● Tarzan raised Desi Arnaz rat.
● Able was I ere I saw Elba (supposedly said by 
Napoleon)
● Doc note I dissent, a fast never prevents a fatness, 
I diet on cod. ©2000 Timothy G. Standish
 DNA Palindromes
● Because DNA is double stranded and the strands 
run antiparallel, palindromes are defined as any 
double stranded DNA in which reading 5’ to 3’ 
both are the same
● Some examples:

● The EcoRI cutting site:
–  5'­GAATTC­3'
–  3'­CTTAAG­5'
● The HindIII cutting site:

–  5'­AAGCTT­3'
–  3'­TTCGAA­5' ©2000 Timothy G. Standish
 Uses of Restriction 
Endonucleases
● Because restriction endonucleases cut specific 
sequences they can be used to make “DNA 
fingerprints” of different samples of DNA.  As 
long as the cutting site changes on the DNA or 
the distance between cutting sites changes, 
fragments of different sizes will be made.
● Because Type II restriction endonucleases cut 
only at palindromes, they leave “sticky ends” that 
will base pair with any other fragment of DNA 
cut with the same enzyme.  This is useful in 
cloning. ©2000 Timothy G. Standish
 R. E.s and DNA Ligase 
Can be used to make recombinant DNA
EcoRI
EcoRI GAATTC
GAATTC
CTTAAG
CTTAAG
1 Digestion AATTC
G
G
CTTAA 2 Annealing of sticky ends
Ligase
G AATTC
CTTAA G
4 Recombinant DNA
3 Ligation G AATTC
CTTAA G
©2000 Timothy G. Standish
 Gel Electrophoresis
● Separates DNA (or RNA or Protein) fragments on the 
basis of charge and size
● Because DNA is an acid, it looses protons in basic 
buffers, thus it has a negative charge that should be 
uniform per unit length
● Agarose (a polysaccharide) or other gel matrices are 
difficult for large DNA fragments to move through
● The larger the fragment, the more difficulty it has 
moving through gels
● By placing DNA in a gel, then applying a voltage 
accross the gel, the negatively charged DNA will move 
toward the positive pole
● Large fragments lag behind while small fragments move 
throght the gel relatively rapidly ©2000 Timothy G. Standish
Gel Electrophoresis

Wells

©2000 Timothy G. Standish

Gel Electrophoresis

Wells

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 Gel Electrophoresis
­
Wells
Large

Direction 
of
DNA
Travel

Small

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