Dogma Central de la Biologa Molecular:

Replicacin de DNA Reparacin de DNA Recombinacin

Replicacin del DNA: generacin de una copia exacta del genoma de una clula

Transcripcin Reversa (Virus)

Sntesis de RNA (Transcripcin)

Sntesis de Protenas (Traduccin)

El DNA Acta como Molde para su propia Sntesis

El nucletido A slo se aparear con xito con T y G con C, por lo que cada cadena de DNA puede especificar la secuencia de nucletidos de su cadena complementaria. As, la doble hlice de DNA se puede copiar fielmente.
Figure 5-2 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

La Replicacin del DNA es Semiconservativa

Doble hlice parental

En cada ronda de replicacin, cada una de las dos hebras es usada como templado (molde) para la formacin de una hebra de DNA complementaria. Por lo tanto las hebras originales de DNA permanecen intactas durantes muchas duplicaciones celulares.

Dobles hlices de DNA hijas

Replicacin del DNA

La sntesis del DNA transcurre en direccin 5 3
Molcula de DNA de Doble Hebra
5 3 5 3

Separacin de las hebras

3 5 5 5 3 3

3 3 5 3 5

Sntesis de hebras nuevas

5 5 3

Dos nuevas molculas de DNA de doble hebra

3 5 3 5

Reaccin Catalizada por la DNA Polimerasa

La DNA Polimerasa cataliza la adicin de un desoxirribonucletido al extremo 3-OH de una cadena de polinucletidos, por lo tanto la nueva cadena de DNA se sintetiza en el sentido 5 3. El apareamiento de bases entre el desoxirribonucletido entrante y la cadena molde gua la formacin de la nueva cadena de DNA, la cual, por lo tanto, tendr una secuencia de nucletidos complementaria a la de la cadena molde. Los nucletidos entran en la reaccin como desoxirribonuclesidos trifosfato. La rotura del enlace fosfoanhdrido (indicada por el asterisco) del nuclesido trifosfato entrante entrega la energa necesaria para la reaccin de polimerizacin.

Burbuja u Ojo de Replicacin

La Horquilla de Replicacin es Asimtrica

Estructura de la Horquilla de Replicacin

hebras de DNA sintetizadas ms recientemente

templado de la hebra retrasada

templado de la hebra lder

Como ambas hebras hijas son sintetizadas en la direccin 5 a 3, la sntesis del DNA en la hebra retrasada debe realizarse inicialmente como una serie de molculas cortas de DNA, llamadas Fragmentos de Okazaki.

Iniciacin de los Fragmentos de Okazaki con Partidores de RNA

DNA templado iniciacin de sntesis de RNA sntesis del partidor de RNA extensin del partidor de RNA por DNA polimerasa

DNA Primasa

DNA Polimerasa

Sntesis de Partidores de RNA por DNA Primasa

A diferencia de la DNA polimerasa, esta enzima puede iniciar la sntesis de una cadena polinucleotdica por la unin de dos nucletidos. La primasa se detiene luego de la sntesis de un polinucletido corto, dejando un extremo 3OH disponible para la elongacin por la DNA polimerasa.

partidor de RNA

sntesis de un nuevo partidor de RNA por DNA primasa

templado de hebra retrasada

DNA polimerasa elonga desde el nuevo partidor para iniciar nuevo fragmento de Okazaki

Sntesis de uno de los Fragmentos de DNA en la Hebra Retrasada

DNA polimerasa termina el nuevo fragmento de DNA

partidor de RNA removido y reemplazado por DNA

En eucariontes, los partidores de RNA son sintetizados a intervalos separados en alrededor de 200 nucletidos en la hebra retrasada y cada partidor es de 10 nucletidos de largo. Este partidor es borrado y reemplazado por DNA. Los fragmentos de Okazaki son unidos por DNA ligasa.

Espacio (nick) sellado por DNA ligasa El nuevo fragmento de Okazaki se incorpora a la cadena creciente

DNA Polimerasas de Procariontes y Eucariontes

E. coli
I

Levaduras
I

Mamferos

Funcin
Relleno de espacios durante replicacin (en fragmentos de Okazaki) y reparacin de DNA Relleno de espacios Replicacin desde templados daados Elongacin de cadena de DNA en la horquilla de replicacin

II

II

III

III

Direccin de movimiento de la Horquilla de Replicacin

Helicasa Protenas de Unin a DNA De Hebra Simple

Accin de Helicasas
y

Hebra Lder

Hebra Retrasada

Protenas de Unin a DNA de Hebra Simple

Protenas que Actan en la Horquilla de Replicacin

hebra lder DNA polimerasa III sobre hebra lder

Topoisomerasa templado de la hebra lder partidor RNA protenas de unin a DNA de hebra simple helicasa

primasa
templado de la hebra retrasada DNA parental

fragmento de Okazaki

DNA polimerasa III sobre hebra retrasada

Se muestran dos molculas de DNA polimerasa, una sobre la hebra lder y otra sobre la retrasada. La DNA helicasa va desenrollando y separando la doble hlice del DNA paterno delante de la DNA polimerasa. Las protenas de unin a DNA de hebra simple mantienen las hebras separadas, permitiendo el acceso a la primasa y la polimerasa.

Orgenes de Replicacin en Procariontes y Eucariontes

eucariontes

procariontes

Actividad Correctora de Pruebas de la DNA Polimerasa Durante la Replicacin del DNA (Proofreading)

Replicacin de DNA Reparacin de DNA Recombinacin

Transcripcin Reversa (Virus)

Sntesis de RNA (Transcripcin)

Copia de una secuencia de DNA a RNA

TRANSCRIPCIN DEL DNA:

Sntesis de Protenas (Traduccin)

Tipos de RNA dentro de la Clula -Codificante: RNA mensajero (mRNA), codifica para protenas -No Codificante:
RNA Ribosomal (rRNA): 28S, 18S, 5,8S, 5S (eucariontes) forman parte de la estructura del ribosoma y participan en la sntesis de protenas RNA de Transferencia (tRNA) utilizados en la sntesis de protenas como un adaptador entre el RNA y los aminocidos RNA pequeos:

- RNAs que regulan expresin gnica: Micro RNAs miRNA), RNAs pequeos de interferencia (siRNA), RNAs cortos en horquilla (shRNA): Regulan la expresin gnica al desestabilizar mRNAs o impedir su traduccin.
- RNAs que procesan o modifican otros RNAs: RNAs nucleares pequeos (snRNA), RNAs nucleolares pequeos (snoRNA), RNAs pequeos de cajal (scaRNA),

La Transcripcin produce una hebra de RNA complementaria a una de las dos hebras del DNA

Figure 6-7 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

RNA polimerasa
promotor

seal de terminacin para RNA polimerasa

Transcripcin
La transcripcin es llevada a cabo por la RNA POLIMERASA La RNA polimerasa se une a una secuencia especial llamada PROMOTOR, que est en el lado 5 (ro arriba) del gen que ser transcrito. La doble hlice de DNA es desenrrollada (alrededor de 10 nucletidos) y la sntesis de RNA procede en la

doble hlice de DNA

ABERTURA DE LA DOBLE HLICE DE DNA

sitio de iniciacin de transcripcin

INICIACIN DE LA HEBRA DE RNA POR UNIN DE DOS RIBONUCLESIDOS TRIFOSFATO

ELONGACIN DE LA HEBRA EN DIRECCIN 53 POR ADICIN DE RIBONUCLESIDOS TRIFOSFATO

la hebra de RNA es contnuamente desplazada por DNA, reformando la doble hlice de DNA

direccin 5 3
regin corta de hlice DNA/RNA

La sntesis finaliza cuando la RNA polimerasa encuentra una

TERMINACIN Y LIBERACIN DE LA POLIMERASA Y LA HEBRA DE RNA TERMINADA

seal de terminacin de
transcripcin. Se liberan la polimerasa y la hebra de RNA terminada.

Estructura de Promotores de Procariontes

secuencia 10 (Caja Pribnow o Caja TATA) Sitio de inicio de transcripcin +1

secuencia 35

5 TAGTGTATTGACATGATAGAAGCACTCTACTATATTCTCAATAGGTCCACG 3 3 ATCACATAACTGTACTATCTTCGTGAGATGATATAAGAGTTATCCAGGTGC 5
11 15 pb hebra de DNA templado Sitio de desenrrollamiento 5 8 pb Transcripcin

5 AGGUCCACG 3

RNA
La RNA polimerasa se une a dos secuencias del promotor, que se encuentran 10 nucletidos ro arriba (posicin 10 aproximadamente) y 35 nucletidos ro arriba (35), respectivamente, del sito de inicio de la transcripcin. El RNA es sintetizado a partir del sitio de inicio (nucletido +1), utilizando como templado la hebra complementaria a la cual se encuentra el promotor.

Elongacin de la Transcripcin Mediada por RNA Polimerasa

Hebra notemplado de DNA ribonuclesidos trifosfato entrantes

sitio de reenrollamiento

sitio de desenrollamiento regin corta de doble hlice DNA/RNA Hebra templado de DNA

hebra nueva de RNA (desplazada)

La RNA polimerasa desenrolla contnuamente la doble hlice de DNA delante del sitio de polimerizacin, mientras va reenrollando las dos hebras de DNA detrs de este sitio, desplazando a la hebra de RNA recientemente sintetizada. Por lo tanto se forma transitoriamente una regin corta de doble hlice DNA/RNA y el producto de RNA final es liberado como una copia de simple hebra de una de las hebras de DNA.

Hebra de RNA creciente

Hebra de DNA templado

Reaccin de Polimerizacin Mediada por la RNA Polimerasa

El ribonuclesido trifosfato entrante es seleccionado por apareamiento con la hebra templado de DNA; un ribonuclesido monofosfato es adicionado al extremo 3-OH de la hebra creciente de RNA (flecha roja) y se libera pirofosfato(tomos rojos). La nueva hebra de RNA crece, por lo tanto, un nucletido a la vez, en la direccin 5 3 y es complementaria a la hebra templado del DNA.

Ribonuclesido trifosfato entrante Direccin 5 3 de crecimiento de la hebra

Terminacin de la Transcripcin en Procariontes:

Rho-Dependiente Rho es un factor de tmino de la transcripcin. Es una helicasa ATP-dependiente. Se mueve a lo largo del transcrito de RNA, encuentra la burbuja, desenrrolla y libera la cadena de RNA.

Rho-Independiente Sitios de termino en el DNA: Repetidos invertidos, ricos en G:C, los cuales forman una estructura en horquilla en el transcrito de RNA.

Termino de la transcripcin Rho-Dependiente

Sitio rico en G:C

RNA Pol se hace lenta

Rho helicasa la alcanza

Complejo de elongacin es desensamblado

Repeticin invertida

4A

Terminacin de la Transcripcin RhoIndependiente

Formacin de horquilla

Disociacin del RNA de la hebra molde del DNA

Un Ciclo Transcripcional en Procariontes

La Iniciacin de la Transcripcin en Eucariontes Requiere de Factores Generales de Transcripcin

Ensamblaje de los factores generales de transcripcin requeridos para la iniciacin de transcripcin por la RNA polimerasa II. Primero TFIID se une a la caja TATA (~25 en eucariontes). TFIIB se une a este complejo, seguido por la RNA polimerasa II, escoltada por TFIIF. Luego TFIIE y TFIIH se ensamblan sobre el complejo. En presencia de ATP, TFIIH fosforila a la RNA polimerasa II, lo cual libera a la polimerasa de este complejo, para que pueda iniciar la sntesis de RNA. Las otras dos RNA polimerasas, I y III, requieren de otros factores generales de transcripcin y no dependen de una caja TATA.

RNA Polimerasas de Eucariontes

Nombre RNA Polimerasa I RNA Polimerasa II RNA Polimerasa III

Tipo de RNA Sintetizado RNAs ribosomales grandes (rRNA 28S, 18S y 5,8S) mRNA, snoRNA, miRNA, siRNA, snRNA rRNA 5S, tRNA, snRNA, otros RNAs pequeos

Los procariontes tienen una sola RNA polimerasa, que transcribe todos los tipos de RNA. La de E. Coli est formada por 5 subunidades, , b, b y s.

Comparacin de mRNAs de Procariontes y Eucariontes

Maduracin del RNA en Eucariontes

Para Producir un mRNA Traducible La transcripcin de un gen eucarionte da origen a un RNA mensajero (mRNA) que no est listo an para ser traducido (pre-mRNA). Estos son procesados para convertirlos en mRNAs maduros. Las modificaciones que sufren son Adicin del cap o caperuza en el extremo 5 (iniciacin de sntesis de protenas y proteccin del transcrito creciente de la degradacin). Adicin de una cola de poli(A) en el extremo 3 (exportacin del mRNA maduro hacia el citoplasma, estabilidad de mRNAs en el citoplasma y sirve de seal de reconocimiento para el ribosoma, requerida para una traduccin eficiente. Splicing o corte y empalme (eliminacin de intrones)

Sntesis de un Transcrito Primario de mRNA

RNA polimerasa II sitio de inicio del RNA sitio de adicin de poli(A) DNA

transcrito naciente de RNA

Adicin del cap (capping)

Elongacin de la hebra

Elongacin de la hebra

La adicin del cap ocurre durante la transcripcin por RNA polimerasa II, sobre la hebra de RNA naciente. Luego de que la hebra terminada es cortada en el extremo 3, se produce la adicin de la cola de poli(A), completando el TRANSCRITO PRIMARIO.

Adicin de poli(A)

poli(A)

Transcrito primario de mRNA (precursor de mRNA)

Adicin del Cap del Extremo 5 de los mRNAs de Eucariontes

7-metilguanosina Extremo 5 del mRNA

Enlace 5 5 trifosfato

La 7-metilguanosina se une al nucletido del extremo 5 del transcrito por un enlace 5-5. La ribosa del primer nucletido del RNA transcrito tiene una metilacin en el 2-OH

Adicin de la Cola de Poli(A)

10-30 nucletidos

AAUAAA
Seal de Poliadenilacin

AAAAAAAAAAAAAAAA
Cola de Poli(A) (100-200)

El extremo 3 de la mayora de los transcritos de la RNA polimerasa II se define, no por un evento de terminacin de transcripcin, sino por el corte del transcrito en un sitio especfico y la adicin en el extremo 3 cortado La seal para el corte es la secuencia AAUAAA, localizada 10-30 nucletidos ro arriba del sitio de corte, llamada seal de poliadenilacin. Despus del corte, la enzima poli-A polimerasa adiciona 100-250 residuos de A al extremo 3 de la hebra de RNA para completar el transcrito primario

Estructura de Genes de Procariontes y Eucariontes

Mientras que los genes de los procariontes son contnuos, es decir la secuencia del mRNA maduro es la misma que el DNA templado, los genes de eucariontes suelen tener secuencias internas que no son codificantes, por lo cual no existen en el mRNA maduro y, por ello, deben ser removidos del transcrito primario antes de la traduccin. Estas secuencias que no codifican se llaman INTRONES y las regiones codificantes se llaman EXONES.

Splicing de Transcritos Primarios

DNA

RNA

Mecanismos de Splicing: Splicing Mediado por el SPLICEOSOMA

Sitio 5 de splicing snRNPs intrn Ensamblaje del Spliceosoma Paso 1 Formacin del lazo (lariat) y corte en el sitio de splicing 5 Sitio 3 de splicing

Exn A

Exn B

mRNA precursor

Paso 2 corte en el sitio de splicing 3 y ligacin de exones Intrn liberado en forma de lazo (lariat)

mRNA maduro (exones ligados)

El Spliceosoma es una ribonucleoprotena formada protenas y snRNAs y otros componentes. En un primer paso, el punto de ramificacin A, que se localiza cerca del extremo 3 de splicing, produce un corte en el sitio 5 de splicing, generando un enlace covalente entre ambos puntos. En el segundo paso, el extremo 3 libre del primer exn, resultante de la reaccin anterior, se une al primer nucletido del siguiente exn, cortando la molcula de RNA en el sitio de splicing 3. Los dos exones quedan unidos entre s, liberando el intrn como un lazo (lariat).

Transcripcin: Diferencias entre Procariontes y Eucariontes

Transcripcin Traduccin Transcripcin Maduracin de mRNA

Clula Procarionte

Los procariontes (bacterias) no tienen ncleo. La traduccin ocurre simultneamente con la transcripcin.
Envoltura nuclear
Traduccin

Clula Eucarionte

Los eucariontes segregan la transcripcin en el ncleo. El mRNA es procesado, exportado del ncleo y traducido en el citoplasma.

molcula de DNA

Gen 1

Gen 2 Gen 3

templado de DNA Transcripcin

TRADUCCIN: Sntesis de una Protena a partir de la Secuencia de un RNA Mensajero

Cada aminocido es especificado por una palabra de 3 bases nitrogenadas o CODN

Traduccin

El Cdigo Gentico
SEGUNDA BASE

Es Universal: un codn en un
organismo especifica el mismo aminocido en cualquier otro

No es ambiguo: cada codn

codifica para un slo aminocido
PRIMERA BASE (extremo 5)

Es Degenerado: un

aminocido puede ser codificado por ms de un codn. La variabilidad suele estar en la tercera base del codn. Los codones especiales son: AUG codn de inicio y metionina UAA/UGA/UAG codones de trmino (codones sin sentido)

Traduccin
El mRNA es traducido en el ribosoma a protena. Cuando el ribosoma se une al sitio de inicio en el mRNA, comienza a leerlo, 3 nucletidos a la vez (codones).

tRNA con aminocido unido

El ribosoma no adiciona aminocidos libres, sino que los a se encuentran unidos a un RNA especial llamado RNA de Transferencia (tRNA), que posee una regin complementaria al codn, llamada anticodn.

Comparacin entre Ribosomas de Eucariontes y Procariontes

Subunidad mayor

Subunidad menor

Subunidad mayor

Subunidad menor

RIBOSOMA PROCARITICO

RIBOSOMA EUCARITICO

Los componentes de los ribosomas se designan por su valor S, que define la velocidad de sedimentacin en una ultracentrfuga.

RNA de Transferencia (tRNA)

Sitio de unin de aminocidos Sitio de unin de aminocidos

Enlaces de hidrgeno

La estructura de trbol del tRNA. Hay al menos un tRNA para cada aminocido. En todos los tRNA, el a se encuentra unido a la A de la secuencia CCA del extremo 3. Un tRNA con un aminocido unido se llama aminoacil-tRNA. La aminoacil tRNA sintetasa adjunta un aminocido especfico a un tRNA especfico.

Formacin de un Enlace Peptdico

peptidil-tRNA unido al extremo carboxiloterminal de la cadena polipeptdica creciente

aminoaciltRNA

molcula de tRNA liberada de su unin al polipptido

Incorporacin de un aminocido a una protena. Una cadena polipeptdica crece por la adicin secuencial de aminocidos a su extremo carboxilo-terminal.

nueva molcula de peptidil-tRNA unida al extremo carboxiloterminal de la cadena polipeptdica creciente

Etapas de la Traduccin
Iniciacin Elongacin Terminacin

el ribosoma se une al codn de inicio del mRNA

la cadena polipeptdica es elongada por la sucesiva adicin de aminocidos

cuando aparece un codn de trmino, el polipptido es liberado y el ribosoma se disocia

Iniciacin de la Traduccin
Existe un tRNA iniciador especial que tiene unida una metionina.
tRNA de inicio

El ribosoma se ensambla en el sitio de inicio con la ayuda de factores de iniciacin Hay 3 sitios en el ribosoma que unen aminoacil-tRNAs: A = acepta un nuevo tRNA P = aqu se forma un enlace peptdico E = sitio de salida para tRNAs vacos
Sitio P (unin de peptidil-tRNA) Sitio A (unin de aminoacil-tRNA) Subunidad Mayor Subunidad Menor

sitio de unin de mRNA

subunidad menor

subunidad mayor

Sitio E (salida de tRNA vaco)

Sitio de unin de mRNA

Reconocimiento del Codn de Inicio en Procariontes y Eucariontes

Secuencia de Shine-Dalgarno

desplazamiento (scanning) de la subunidad menor del ribosoma

En procariontes, el ribosoma reconoce la secuencia de Shine-Delgarno que precede al codn de inicio y es complementaria al extremo 3 del rRNA 16S de la subunidad menor del ribosoma. Los ribosomas de eucariontes reconocen los caps de 7-methylguanosine y luego recorren el mRNA buscando el primer AUG de inicio. En procariontes, el aminocido de iniciacin es siempre formil-metionina (fMet).

Elongacin: Un Ciclo de Traduccin

Extremo amino-terminal del polipptido Reconocimiento del codn: Un aminoacil-tRNA entrante se une al codn en el sitio A

Ribosoma listo para el siguiente aminoacil-tRNA

Translocacin: El tRNA en el sitio A es translocado al sitio P, llevando consigo el mRNA. Mientras tanto, el tRNA en el sitio P se va al sitio E, siendo liberado finalmente del ribosoma. El mRNA ha cambiado su posicin en el ribosoma en un codn.

Formacin del enlace peptdico: El ribosoma cataliza la formacin de un enlace peptdico entre el a nuevo y el extremo carboxiloterminal del polipptido creciente.

Terminacin de la Traduccin
Factor de liberacin polipptido libre

codn de trmino (UAA, UAG, UGA)

La unin de un factor de liberacin a un codn de trmino pone fin a la traduccin. El polipptido es liberado y el ribosoma se disocia en sus dos subunidades.
El factor de liberacin es una protena. Los codones de trmino no codifican para aminocidos.

Ejercicio: Suponiendo que la siguiente secuencia corresponde a un mRNA completo, de cuantos aminocidos constar la protena resultante de su traduccin? 5 CAGUCAUGCCAGUCGGAUAGACGUAGAUGAUCC 3
Met Pro Val Gly Stop

4 aminocidos

No codifica para aminocidos

Polirribosomas
Una molcula de mRNA puede ser traducida simultneamente por una serie de ribosomas, tanto unidos a membranas como en forma libre. Estas estructuras se llaman polirribosomas o polisomas. Ocurren tanto en eucariontes como en procariontes.

La Transcripcin y la Traduccin estn Acopladas en Procariontes

En los eucariontes, la envoltura nuclear mantiene la transcripcin separada de la traduccin. Pero en procariontes, el mRNA es accesible a los ribosomas mientras se va sintetizando. Por lo tanto, los ribosomas comenzarn a sintetizar un polipptido en el extremo 5 de una molcula naciente de mRNA y seguirn su sntesis detrs de la RNA polimerasa, a medida que sta completa la cadena de mRNA.