POPULATION D ADN COMPLEXE - ADN gnomique ou - copie d ARNm = CDNA

Amplification spcifique

Dtection spcifique

Clonage dans des vecteurs - vecteur - lier le fragment d ADN au vecteur - transfert dans lhte

Amplification in vitro

PCR
- polymrase thermostable -information sur la squence permettant de gnrer des amorces damplification

Hybridation molculaire - Sonde ADN ou ARN

marque

LE CLONAGE

I - Proprits des vecteurs de clonage

capables de rplication autonome dans une cellule hte donne (origine de rplication de type procaryotique et/ ou eucaryotique)

possdent un polylinker ou site multiple de clonage

Molecular Cell Biology

Molecular Cell Biology Possdent des proprits permettant la slection de la cellule hte (rsistance ATB) supportent linsertion dun fragment dADN plus ou moins grand

II Principes gnraux dutilisation dun vecteur

- Prparation du vecteur - Prparation de lADN insrer - Ralisation dun recombinant - Incorporation lhte

Obtention de lADN recombinant

+ traitement PAL

An Introduction to Genetic Analysis

La ligation (ligature...)

Une enzyme, la ligase, est capable de lier de faon covalente deux molcules dADN en une.
Molecular Cell Biology

Diffrents vecteurs de clonage

Taille maximum approximative du fragment dADN qui peut tre clon dans chaque vecteur

Type de vecteur
Plasmide Phage lambda Cosmide Phage P1 BAC(bacterial artificial chromosome) YA C (yeast artificial chromosome)

ADN clon en kb
10 25 45 100 300 1000

Les plasmides comme vecteurs de clonage (1)

Molcule dADN de taille rduite, d'origine bactrienne Molcule dADN circulaire taille 2kb 5kb Peut accepter jusqu 10kb dADN exogne Peut tre considre comme un minichromosome capable de rplication autonome Confre la rsistance un ou plusieurs antibiotiques= slection

Molecular Cell Biology

Les plasmides comme vecteur de clonage (2)

II Principes gnraux dutilisation dun vecteur

Dfinition Le squenage de lADN, est la dtermination de la succession des nuclotides le composant. - Prparation de lADN insrer Cest aujourd'hui une technique de routine pour les

- Prparation du vecteur

- Ralisation dun recombinant laboratoires de biologie.

Cette technique utilise les connaissances qui ont t

- Incorporation lhte

acquises depuis une trentaine d'annes sur les mcanismes de la rplication de l'ADN.

Introduction de lADN recombinant dans les cellules htes De type procaryotique (bactries): Cas dun vecteur plasmidique: lADN est introduit dans les bactries traites spcialement le plus souvent par choc thermique ou par choc lectrique.

lectroporateur

Identification des clones intressants

Dans ce cas les bactries transformes avec le vecteur ne possdant pas ou possdant linsert sont slectionnes --> un criblage est ncessaire

Molecular Cell Biology

pBR322

Criblage des clones intressants (3)

AmpR TetR

AmpR TetS Clone intressant

Dfinition Le squenage de lADN, est la dtermination de la succession des nuclotides le composant. Cest aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. Cette technique utilise les connaissances qui ont t acquises depuis une trentaine d'annes sur les mcanismes de la rplication de l'ADN.

Criblage -screening- des clones intressants (2)

Test blanc-bleu (Ecomplmentation)

An Introduction to Genetic Analysis

III - Diffrents vecteurs de clonage

Taille maximum approximative du fragment dADN qui peut tre clon dans chaque vecteur

Type de vecteur
Plasmide Phage lambda Cosmide Phage P1 BAC(bacterial artificial chromosome) YA C (yeast artificial chromosome)

ADN clon en kb
10 25 45 100 300 1000

Les phages comme vecteurs de clonage

Phage = virus de bactries

Molecular Cell Biology

Dfinition Le squenage de lADN, est la dtermination de la succession des nuclotides le composant. Cest aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. Cette technique utilise les connaissances qui ont t acquises depuis une trentaine d'annes sur les mcanismes de la rplication de l'ADN.

Introduction de lADN recombinant dans les cellules htes

De type procaryotique: Cas dun vecteur phagique

Les cosmides comme vecteurs de clonage

Molecular Cell Biology

Les YACs comme vecteurs de clonage

YAC : Yeast Artificial chromosome

Criblage dune banque phagique

Hybridation avec uns sonde spcifique... Prochain cours!

An Introduction to Genetic Analysis

IV - APPLICATIONS DES VECTEURS

- Clonage et amplification dune squence dADN - Cration des banques dADN gnomiques et dADNc - Introduction dun gne dans des cellules, des plantes ou des organismes(animaux transgniques) - Production dARN - Production de protines codes par les gnes insrs

Banques dADN
-Banques dADN gnomique - Banques de cDNA

Banque (librairie) dADN gnomique

Molecular Cell Biology

Comment dfinir si une banque est suffisamment grande pour esprer trouver un fragment dintrt?
Calcul afin de dfinir la probabilit de trouver une squence donne dans une banque. N=ln(1-P)/ln(1-f) N: nombre de recombinants P: probabilit dsire f: proportion de gnome dans un seul recombinant Ex: 99% de probabilit davoir une squence reprsente dans une banque de fragments de 17kb dun gnome eucaryote (3.109pb) N= ln(1-0.99)/ln(1-(1,7.104/ 3.109))=8,1.105 colonies

Banque dADNc
Le problme ici est lobtention de clone dit full length .

Obtention de lADN de lorganisme donneur

A partir de lARN: Principe de la "reverse transcription":

An Introduction to Genetic Analysis

APPLICATIONS DES VECTEURS

Dfinition - Clonage et amplification dune squence dADN Le squenage de lADN, est la dtermination de la - Cration des banques dADN gnomiques et dADNc succession des nuclotides le composant. Cest aujourd'hui une codes par les gnes insrs - Production de protines technique de routine pour les laboratoires de biologie. -Introduction dun gne dans des cellules, des plantes ou Cette technique utilise les connaissances qui ont t des organismes(animaux transgniques) acquises depuis une trentaine d'annes sur les mcanismes de la rplication de l'ADN.

Production de protines Utilisation de vecteur dexpression

Molecular Cell Biology

Production de protines humaines but thrapeutique

- Facteur VIII de la coagulation dans lhmophilie A - Hormone de croissance - Insuline

Exemple de linsuline

CELLULES HTES -Bactries : E. Coli

premier hte utilis nombreux vecteurs plasmidiques connus et utilisables Dfinition en masse dans les fermenteurs culture taux dexpression levs dtermination protine/litre) Le squenage de lADN, est la (plusieurs g dede la

succession des mal les protines : clatement des bactries MAIS secrtentnuclotides le composant. Cest pas de modifications post-traductionnelles aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. -Levure saccharomyces cerevisiae modifications post traductionnelles Cette technique utilise les connaissances qui ont t MAIS pas de secrtion, moins bon rendement acquises depuis une trentaine d'annes sur les -Cellules CHO la rplication de l'ADN. mcanismes de(chinese hamster ovary) culture de masse en bioracteurs, protines complexes MAIS cher et rendement plus faible

Autres exemples
Levures et bactries utilises comme usines: production d'antibiotiques -pnicilline, ttracycline-, d'enzymes comme lipases -lessives-... Vaccins : fraction de protines virales ncessaire la production dAC Bioractifs Enzymes de restriction diminution du cot

Cration de plantes transgniques

An Introduction to Genetic Analysis

Cration danimaux transgniques