Proteasas Parasitarias

Proteasas
Definicin
Se trata de enzimas capaces de hidrolizar los enlaces peptdicos (subclase E.C 3.4) Protelisis limitada: limitado nmero de enlaces hidrolizables Protelisis ilimitada: proteasoma, lisosomas

Enlace Peptdico
Caractersticas
Plano Rgido Polar Restringe conformacin de la cadena polipeptdica

El Problema Qumico

Proteasas Nomenclatura

Proteasas
Nomenclatura de Schercher y Berger

Proteasas
Clasificacin segn mecanismo de accin
Serina proteasas Cistena proteasas Metaloproteasas Asprtico proteasas Treonina proteasas Glutmico proteasas

Proteasas
Clasificacin
Familia: homologa significativa a nivel de secuencia de amino cidos en la porcin cataltica. Clan: Grupos de familias que han evolucionado a partir de una protena ancestral. Similitud a nivel de estructura tridimensional

Proteasas en los Genomas Eucariotas

Serina proteasas
Generalidades
Familia de Qumiotripsina: Tripsina, elastasa, factores de la coagulacin XIIa, XIa, IXa, plasmina Familia Subtilisina, enzimas bacterianas Trada cataltica

Serina Proteasas
Mecanismo de Accin Cataltica
Trada Cataltica: His57, Asp102 y Ser195 -Formacin de acil intermediario entre el substrato y la Ser Formacin de este intermediario covalente se produce a travs de un intermediario tetrahdrico de transicin cargado negativamente Se cliva el enlace pepttico

Serina Proteasas
Mecanismo de Accin Cataltica (cont.)

Fase de deacilacin El intermediario acilenzima se hidroliza por una molcula de agua liberado el pptido y restaurando el hidroxilo en Ser La His provee una base y acepta el OH de la Ser reactiva

Cistena Proteasas
Generalidades
Papana, catepsinas lisosomales B, H y L Calpanas citoslicas Dada cataltica: Cis25, His159 juegan los mismos roles que Ser e His en serina proteasas

Cistena Proteasas
Mecanismo de Accin Cataltica
La catlisis tambin se produce a travs de la formacin de un intermediario covalente e involucra a Cys e His El nuclefilo es en este caso un ion tiolato en lugar de un grupo hidroxilo El tiolatio se estabiliza por la formacin de un par inico con el imidazol vecino en la His El ataque nucleflico es en este caso el par inico tiolatoimidazol en ambos pasos, por tanto no se requiere una molcula de H2O2

Metaloproteasas
Generalidades
Amplias differencias en secuencias y estructura La gran mayora contienen Zn en sitio activo Ej: Termolisina, metaloproteasas de la matriz extracelular (MMPs), algunas aminopeptidasas

Sito activo de la termolisina mostrando Zn, HIS142, HIS146 and GLU166.

Metaloproteasas
Mecanismo de Accin
El mecanismo cataltico lleva a la formacin de un intermediario tetrahdrico no covalente luego del ataque de la molcula de H2O unida al Zn sobre el grupo carbonilo del enlace peptdico. El intermediario se descompone por la transferencia del protn del cido glutmico al grupo NH

Asprtico Proteasas
Generalidades
Ejemplos: Familia de la Pepsina:catepsina D, renina Familia de proteasas del HIV (retropepsina). Son monomricas, por lo que la dimerizacin se requiere para formar la enzima activa Se trata de enzimas bilobuladas donde el sitio activo est entre dos lbulos homlogos. Cada lbulo contribuye con un aspartato El pH ptimo es cido para la mayora de las asprtico proteasas, donde un protn est compartido por los dos aspartatos del sitio activo El agua es activada por los aspartatos para realizar el ataque nucleoflico

Asprtico Proteasas
Mecanismo de Accin
Los 2 residuos aspartil tienen una gran proximidad geomtrica en la molcula Un aspartato se ioniza mientras que el segundo no lo est al rango de pH ptimo de 2-3 La catlisis de las asprtico proteasas no involucra la gneracin de un intermediario covalente si bien existe un intermediario tetrahdrico. El ataque nucleoflico se consigue por 2 transferencias simultneas de protones: una desde el H2O2 a la dada de dos carboxilos y otra desde la dida al oxgeno carbonilo del substrato con el consiguiente clivaje CO-NH En trminos generales es una catlisis cidobase.

Inhibidores de Proteasas
Bajo Peso Molecular
Cistena: E-64, Leupeptin Serina: Di isopropilfluorofosfato (DFP), PMSF, Benzamidina, Dicloroisocumarina Metalo: EDTA, EGTA, Fenantrolina, Bestatina Asprtico: Pepstatina

Inhibidores de Proteasas
Inhibidores Naturales
Mas de 100 compuestos naturales identificados Desde bacterias a animales y plantas Reversibles o seudo-irreversibles Impiden acceso al sitio activo Proteicos, de 50 a 400 aa Clase especficos excepto familia de Macroglobulina Inhibidores de Serina y Cistena proteasas son los mejor caracterizados. Ej. -1 antitripsina y cistatinas

Metodologa de Estudio
Substratos Cromognicos

Estos substratos, al clivarse generan un compuesto cromognico. La tasa de hidrlisis se mide en Los ms utilizados son pptidos 4-nitroanilides pNA) y pptidos thioesteres

Metodologa de Estudio
Sustratos Fluorgnicos
Generan un compuesto fluorognico al producirse el clivaje. La tasa de hidrlisis se cuantifica por medio de un espectrofluormetro o fluormetro en forma continua o ensayos puntuales. Los sustratos ms usados son los que tienen acoplado AMC (peptidyl 4-metil-7 cumarilamidas).

Metodologa de Estudio
Sustratos con Quenching intramolecular
En estos substratos, la secuencia peptdica separa un grupo fluorescente dador de un grupo aceptor que acta como mitigador (quencher) de fluorescencia. El fenmeno se llama transferencia de energa resonante. El clivaje del enlace peptdico lleva a separacin del par dadoraceptor produciendo un incremento de la fluorescencia. Existen varios pares de dadoraceptor reportadoss, por ej. o-aminobenzoic acid (Abz) como dador y 2, 4 dinitrophenyl (Dnp) como aceptor.

Substratos sintticos
Ejemplos
Cathepsin B Bz-Arg-pNA Pyr-Phe-Leu-pNA Z-Arg-Arg-pNA Z-Phe-Arg-pNA Z-Arg-Arg-MCA Z-Phe-Arg-MCA MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA Suc-Ala-Val-Pro-Phe-pNA Suc-Phe-Leu-Phe-pNA H-Arg-pNA Bz-Arg-pNA H-Arg-MCA Z-Phe-Arg-pNA Z-Phe-Arg-AMC

Cathepsin G

Cathepsin H Cathepsin L

Geles de gelatina-SDS-PAGE gelatina-SDS-

CL1 gelatinolytic activity CL2 29 kDa CL1 27,5 kDa CL2 gelatinolytic activity

SDS-PAGE acoplado a Substratos Fluorognicos

Acciones de las Proteasas Parasitarias en el Contexto del Parasitismo

Invasin Migracin Nutricin Evasin de la respuesta inmune Inmunomodulacin

Invasin y Migracin
Membranas Basales y Matrz Extracelular

Nutricin
Hemoblobina Protenas del suero Protenas intracelulares Protenas extracelulares (MEC)

Evasin de la Respuesta Inmune

Degradacin de Igs (IgG, IgM, IgE, IgA) Degradacin de componentes del Complemento Clivaje de molculas de superificie de clulas del sistema inmune (Ej. CD4)

Inmunomodulacin
La cistena proteasa CPB2.8 de Leishmania mexicana induce una fuerte respuesta de tipo Th2 asociada a la progresin de la enfermedad

Enfermedad de Chagas
Causada por el flagelado Trypanosoma cruzi Parsito heteroxeno 3 formas: Forma replicativa intracelular obligatoria amastigote, forma tripomastigote circulante y forma epimastigota replicativa en el insecto vector

Proteasas de Trypanosoma cruzi

Cistena proteasas
Cruzipana (cruzana, GP57/51) Catepsina B-like proteinasas CAAX Prenyl proteasa

Proteasas de Trypanosoma cruzi

Serina proteasas
Oligopeptidasa B Prolil Endopeptidasa Tc80 (colagenasa) Serina carboxipeptidasa

Proteasas de Trypanosoma cruzi Metaloproteasas

Genes pertenecientes a la familia gp63 de Leishmania, una metaloproteasa asociada a membrana celular han sido descritos en T. cruzi.

Cruzipana
Responsable de la actividad cistena proteasa ms promienente de T. Cruzi Se expresa en todos los estados parasitarios La mayora tiene localizacin lisosomal, pero hay isoformas asociadas a membrana plasmtica y habra alguna secretada Endoproteasa, digiere protenas como casena, SAP, hemoglobina y sustratos sintticos a pH 7-9. Prefiere Arg o Lys en P1 y un hidrofbico o con carga + en P2 (Leu>Tyr>Phe>Val)

Cruzipana
Especificidad intermediaria entre Catepsinas L y B en funcin de AA en P2 Inhibida por organomercuriales, E-64, leupeptin, TLCK, cistatina, stefina, chagasina y derivados peptidil fluorometanos Peptidos con secuencia YHNGAA del pro-dominio tambin la inhiben
E-64

Z-Phe-Ala-fluorometilketona

Cruzipana
Corte de subclases de IgG

Cruzipana
Corte de subclases de IgG

Cruzipana
Corte de subclases de IgG

Malaria
Causada por protozoarios apicomplexa del gnero Plasmodium 300 millones de infectados, ms de un milln de muertes anuales Ciclo complejo, transmitidos por vector invertebrado (mosquito Anopheles)

Proteasas de Plasmodium en la Digestin de la Hemoglobina

Se desarrolla en la vacuola alimenticia Consume el 75% de la Hb Se producen pequeos pptidos pero no AA por lo que existiran transportadores Las Plasmepsinas I - IV son asprtico proteasas implicadas en la primera fase de la digestin Las Falcipanas I y II son cistena proteasas que degradan los polipptidos grandes generados La Falcilysina, una metaloproteasa de la familia M16, degrada los pequeos pptidos Una aminopeptidasa citoslica completara el proceso produciendo AA libres

Plasmepsinas
Nutricin
Degradacin inicial de Hb nativa (plasmepsina I) Clivan enlace Leu203-His204 en regin bisagra de cadena

Plasmepsinas
Invasin
Clivaje de espectrinas (CH3) del esqueleto de la membrana plasmtica del GR

Amebiasis
Infeccin intestinal o extraintestinal causada por Entamoeba histolytica 50 millones de infectados y 110 mil muertes anuales 2 especies reconocidas Entamoeba histolytica patgena Entamoeba dispar comensal (10% poblacin mundial)

Cisteina Proteasas de Entamoeba histolytica y E. dispar

Proteasas en la Patogenia de la Amebiasis

Proteasas como Blancos Teraputicos Inhibidores de CP

Peptidil diazometanos basados en la secuencias LVG de las cistatinas E, F, epoxi ketonas - > potencia que E-64c Bis-arylacylhydrazidas y aril ureas-reversibles Mercaptoetilketonas, algunas con Ki de 1nM

Proteasas como Blancos Teraputicos Inhibidores de CP

La actividad de los inhibidores de CP contra T. Cruzi en cultivos o modelos animales correlaciona con la inhibicin directa de la CP. No se pueden descartar otras acciones. En su mayora los inhibidores tambin actan sobre las catepsinas de mamferos. Las clulas no se ven afectadas por las concentraciones que matan los parsitos. Redundancia?. Los parsitos resistentes a los inhibidores de CP no se mostraron resistente a drogas establecidas como nifurtimox indicando mecanismos diferentes