INTRODUCTION

DEFINITIONS: CELLULE TOTIPOTENTE, PLURIPOTENTE, MULTIPOTENTE, Les diffrentes CS, Clonage Reproductif et thrapeutique RAISON D TRE des CELLULES SOUCHES

Cellules Souches

Quelques dates:
1932: notion d ilots sanguins chez l embryon. 1958: premire greffe de MO sur sujets irradis. 1968: premire greffe de MO sur des DICS (SCID). 1975: Culture de kratinocytes d piderme. Annes 1980: dbut des greffes de peau autologues et de MO allogniques large chelle (traitements anti-rejet). 1981: Cultures de CS embryonnaires de souris (Evans). Annes 1980: Recombinaison homologue (Smithies & Cappechi). 1994: Cultures de CS embryonnaires humaines. 1997: Naissance de Dolly. Un noyau de cellule adulte reprogramm par transfert dans un ovule. Fin 1990-2000: Existence de cellules multipotentes dans diffrents tissus chez l adulte. 2006-2007: Transformation de fibroblastes adultes en CSE en culture (Rajeunissement) par manipulation gntique (Yamanaka).
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Les Cellules souches: Dfinitions I

Si injectes dans un autre embryon: Reforment tous les tissus et des Cellules germinales

L ORGANISME post natal ou ADULTE CONTIENT DES CS dont certaines CAPABLES DE TRANSDIFFRENCIATION

J2 MORULA 4 C CS TOTIPOTENTES

J6-8 Masse interne Du BLASTOCYSTE CS Embryonnaires PLURIPOTENTES

CS MULTI, tri, bi, uniPOTENTES Seule possibilit actuelle ...mais

Mais problmes d obtention, ncessit de banques, Risques de tratomes Professeur Dalloul, Nancy Universit

DEFINITIONS II
L UF EST IL UNE CELLULE SOUCHE ? Stricto sensu NON car il ne s auto renouvelle pas. L UF FECONDE ABOUTIT A L EMBRYON ET AUX ANNEXES EXTRAEMBRYONNAIRES. L UF fcond (diplode) roule dans la trompe et bascule dans la cavit utrine ou il se fixe j5-6. Entre temps il a donn 2 puis 4 (j2) puis 8, 16, (J4) cellules: MORULA. Une cellule de morula j2 est totipotente car elle reconstitue l embryon entier et le placenta si on la transplante chez l animal . Les 3 autre cellules se reprogramment in vivo et reconstituent galement l animal entier. Au-del de 4 cellules ce n est plus vrai (perte irrversible de capacit).

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DEFINITIONS III
A partir de 8 cellules la division n est plus strictement binaire (16/32/64/128). A j5.5-6 (>de 100 cellules) la morula se creuse d une cavit remplie de liquide, et devient un Blastocyste (form d une masse interne de cellules ou Embryoblaste et d une monocouche de cellules externes). Les cellules de la masse interne sont pluripotentes: leur injection dans un autre blastocyste dmontrent qu elles reconstituent tous les tissus in vivo y compris les cellules germinales, mais pas les annexes. On a russi immortaliser ces cellules de la masse interne in vitro: Production de LIGNEES de Cellules souches embryonnaires ES capables: de multiplication l infini en restant indiffrencies, Et de reprogrammation si on les cultive dans un milieu appropri: elles se diffrencient alors en myocytes, chondrocytes, neurones, cellules sanguines etc. Ce sont des cellules souches PLURIPOTENTES

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DEFINITIONS IV
Les Tissus adultes, mais dj ceux du f tus contiennent des cellules mutipotentes (>3, tri, bi ) et unipotentes. Certaines sont capables de Transdiffrenciation: une d un feuillet primitif donn se diffrencie en une cellule provenant d un autre feuillet. ENDODERME NEURECTODERME

MESODERME
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Pourquoi des cellules souches ? Pour viter la mort d un tissu (et de l organisme) ! Une cellule peut rester quiescente, on dit qu elle est hors du cycle cellulaire ou en G0. Exemple typique, le Neurone. D autres cellules prolifrent quasiment en permanence, elles sont en cycle cd en phase G2 ou M. Exemple typique, les Globules Blancs. Voir cours sur le cycle cellulaire.
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Pourquoi des cellules souches ?

Or une cellule ne peut se diviser qu un nombre limit de fois (30-40): limite de HAYFLICK. Pourquoi ? Les Tlomres raccourcissent. Voir cours spcifique. La demi vie d une cellule est variable: 6h pour un polynuclaire neutrophile, 60j pour un GR, illimite pour un neurone. Une fois la limite de Hayflick atteinte, la cellule entre alors en Snescence Rplicative ou bien en Mort Cellulaire Programme ou Apoptose. Voir cours spcifique. Pour remplacer ces cellules, un seul moyen: des cellules capables de se diffrencier (spcialiser) et en mme temps rester en nombre fixe: les cellules souches.
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Pourquoi des cellules souches ?

Un organisme adulte doit fabriquer 1011 1012 cellules par jour

Compartiment de prolifration: la cellule reste indiffrencie

Progniteurs

Compartiment de Maturation: la cellule ne se divise plus La cellule vieillit et meurt

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CONSTATATIONS
LE nombre de CELLULES SOUCHES est QUASI CONSTANT CHEZ LADULTE mme un ge avanc. La capacit de PROLIFERATION des CS diminue avec l ge. Donc anomalies Qualitatives et Quantitatives relativement modres. Le maintien du nombre de cellules d un organisme s appelle l HOMEOSTASIE. Son mcanisme est complexe et reste une des nigmes de la biologie moderne.

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MECANISMES
TROIS SOLUTIONS LOGIQUES: 1) DIVISION ASYMETRIQUE: UNE CELLULE DONNE DEUX CELLULES FILLES DONT L UNE EST IDENTIQUE A LA MERE ET LAUTRE DISTINCTE. 2) L HOMEOSTASIE EST MAINTENUE GRACE A DES INFORMATIONS EXTERNES (Facteurs de Croissance) RECUES PAR LES CS: UNE CS SE DIVISE EN 2 CS TANDIS QU UNE AUTRE CS SE DIVISE EN 2 CELLULES ENGAGEES VERS LA MATURATION. 3) Une cellule diffrencie peut rajeunir ou se ddiffrencier grce une PLASTICITE gnique. Le nombre de cellules engages dans un sens est identique au nombre de cellules engages dans l autre sens. L Homostasie est maintenue.
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SOLUTION 1: UNE DIVISION ASYMETRIQUE

CS 1) C Engage Cas typique des CSH

Informations: Niche Milieu extra cellulaire C en Diffrenciation terminale

MCP ou Apoptose

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SOLUTION 2: DEUX DIVISIONS SYMETRIQUES Et autant de divisions symtriques que de divisions asymtriques

C Souches CS1 CS2

C Engages

Informations: Niche Milieu extra cellulaire

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SOLUTION 3: PLASTICITE GENIQUE Une Cellule fille a la capacit se Ddiffrencier

C Souche Msenchymateuse

Voie 1: exemple Chondrocyte C Fille Plastique

C en Diffrenciation C Diffrencie Terminale

Mcanisme possible pour les CSM Voie 2: exemple, Myocyte

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LA CS est LOCALISEE dans une NICHE Anatomique

Dmontre pour la CSH: Probablement PLUSIEURS NICHES hirarchises de CS de moins en moins multipotentes dans la cavit mdullaire de l os Dmontre pour les CS du FOLLICULE PILEUX Probable pour les CSM de la MO. Localisation ANATOMIQUE prcise en relation avec d autres cellules: Echanges d information travers des molcules d ADHERENCE, des FACTEURS de CROISSANCE, des JONCTIONS (informations sur le METABOLISME, etc)

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La Division de la CS est controle par la Niche

Il existe autant de niches que de cellules souches! La niche de CSH les plus primitives est la face externe de la cavit mdullaire De lOS dite rgion sous endostale. Elle est forme dostoblastes, ostoclastes, vaisseaux sanguins et sans doute Autre cellules: CS msenchymateuses, adipocytes etc et de matrice extracellulaire.

NICHE

Mcanisme de la Division Asymtrique

La DA reste mystrieuse, mais serait lie des facteurs de polarisation Qui rglent le Plan de Division Equateur perpendiculaire au stroma: Cellules souches

Equateur parallle au stroma: Cellules Engages

 Mcanismes Molculaires Mystrieux: Rpartition asymtrique de protines (F de T)? Facteurs qui rglent la Polarisation et le Plan de Division? cf cours sur la mitose Voies biochimiques ??

Rgulation de la Cellule Souche Autorenouvellement. Entre en cycle Migration Ces fonctions sont rgules par des facteurs intrinsques (gnes de multipotence) et des facteurs extrinsques : mtabolisme, signaux mis par des molcules d adhrence, cytokines et chimiokines mises par les cellules filles (rle dans l Homostasie)

Par des techniques dInvalidation de gnes dans les CSE de souris et par des techniques dInterfrence ARN, on comprend progressivement quels sont Les molcules impliques dans la DA, la Prolifration, la Diffrenciation, et

La Migration des CSH, dans la CSH elle mme (F Intrinsques) et dans la Niche (facteurs extrinsques).

Les facteurs Intrinsques : 1) Facteurs de Transcription. Ceux de la Famille HOX (HOX B4) sont impliqus dans lauto-renouvellement de la CSH. 2) Des molcules de signalisation: Voies Wnt, Notch, Rcepteurs aux facteurs de croissance. 3) Des rgulateurs du cycle: Rb, p18, p21 etc.

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Exemple de Rgulation Extrinsque par le milieu : lHypoxie O2

Ubiquitination: destruction

HIF (Hypoxia Inducible Factor)

+
EPO (Erythropoitine)
Epo se lie son Rcepteur sur les Progniteurs Erythroides Do Phosphorylation de JAK2 qui 1) Active la voie de la PI3Kinase et Bclxl (Survie) 2) Phosphoryle un facteur de Transcription STAT5 qui se dimrise et Migre dans le Noyau ou il active les gnes de Prolifration. Note: Implication de jak2 dans la polyglobulie primitive

Do production dErythroblastes qui donnent les GR qui produisent lHb, Transporteur dO2.
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Les facteurs extrinsques produits par le stroma : 1) Le stroma produit des facteurs de croissance : Stem Cell Factor, Interleukines etc 2) Le stroma exprime des molcules dadhrence aux CSH (Intgrines etc ). 3) Le stroma produit de la Matrice extracellulaire qui sert de rservoir certains facteurs de croissance. 4) Des molcules de signalisation: Ligands des molcules Wnt, Notch, 5) Des molcules, les chimiokines qui attirent les CSH: ex le stroma exprime une chimiokine dite CXCL12(SDF1) la surface. Celle-ci attire la CS qui exprime le rcepteur de SDF1: CXCR4.

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La vraie CSH est hors cycle car 1) Elle rsiste la chimiothrapie: ceci est la base des traitements des leucmies aigues. Les CSH possdent une pompe de la famille ATP cassette qui expulse les agents cytotoxiques, et code par le gne Mdr (Multidrug Resistance Gene) et aussi des colorants (Rhodamine).MDR appartient aux transporteurs ABC cassette de liaison lATP. 2) Les cellules qui ne prennent pas ces colorants: Hoechst 33342, rho12, sont enrichies en CSH. On parle de Side Population ou population latrale .

Hoechst 33342

CS: 0.05%

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LA CSH: exp de Till & McCulloch

Kaput ! Irradiation sublthale

On transfre la MO en iv une Souris de la fratrie

La rate (Spleen) Contient des CFU-S

Les colony-forming Unit spleen sont capables leur tour de sauver une Les CFU-S contiennent des Souris irradie en reconstituant CSH Lhmatopose . Et si on recommence la greffe sur une 3me souris, a marche. Conclusion: les CSH sautorenouvellent
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Test de colonies in vitro Cellules de MO milieu semi solide + F de croissance 7-14 J 1 CFU = 1 CS

Progniteur primitif

Progniteur engag Progniteur intermdiaire

Les colonies tardives Viennent des CSH les Plus primitives: LTCIC

On value ainsi le nombre de CSH On estime ces cellules 1/105 environ dans la MO 16 divisions ou doublements pour arriver 1 cellule mure Problme: Ces cellules sont values rtrospectivement, mais on ne sais pas Les isoler individuellement au sein dune population
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Dfinition de la CSH: Une cellule qui reconstitue lhmatopoise in vivo. Une cellule qui protge la souris contre lirradiation. Les tests in vitro sont moins fiables: LTCIC > tests de colonies > CD34+: La fraction CD34 (1% de la MO, 0.3% du sang adulte) est enrichie en CSH, Le caractre CD34+ ne dfini pas une CSH au sens strict

Les Cellules Souches Msenchymateuses

Existent dans quasiment tous les tissus de l adulte. 1970: de la MO cultive faible densit gnre des colonies (CFU-F) pour CFU-Fibroblast, adhrentes non sanguines capables de gnrer os, cartilage, muscle et MO aprs transplantation (Friedenstein). Les CSM peuvent aussi gnrer des tissus non msodermiques: endoderme (Foie), neurectoderme etc.

Le rle physiologique des CSM reste dbattu: Protection contre des microtraumatismes in vivo ? Cellules souches du stroma de MO (ostoblastes adipocytes etc) ?

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O C A

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Facteurs de diffrenciation

Si on enlve les Facteurs de diffrenciation La cellule redevient quiescente

Dans la CSM, Le matre mot est plasticit lautorenouvellement et La progression hierarchique (CSH) sont en option. Comment ? Hypothse: La CSM exprime faiblement un grand nombre de gnes (mesurs par la quantit dARN messager) impliqus dans le caractre multipotent. Sous pression dun facteur de croissance x, elle amplifie la transcription des gnes impliqus dans le Dveloppement de la cellule correspondante, (ex du haut: Os, cartilage, adipocytes).

Blastocyste (sixime jour) CSE: drives en culture

CS Somatiques CS Germinales In vivo

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Les Cellules souches Embryonnaires

Des tumeurs bnignes appeles tratomes (tumeurs monstres) drivent de CSE: tissus dans le dsordre. Des cellules de la masse interne du blastocyste (J5.5 J7.5) sont capables de prolifrer indfiniment: on les cultive sur des cellules nourricires + facteurs de croissance qui les maintiennent indiffrencies: Leukemia Inhibitory Factor (LIF). Si on les injecte dans un autre embryon, sont capables de gnrer tous les tissus d les 3 feuillets primitifs: Endoderme, Msoderme et Ectoderme, et des cellules Germinales. Si on les cultive avec des facteurs de diffrenciation appropris, elles gnres TOUS LES TISSUS EN CULTURE.

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Une CS modifie son transcriptome lors de la diffrenciation: Perte et acquisition de mRNA. Reprogrammation physiologique

Tratome

Cellule souche Muscle

Neurones

Peau

Donc Potion Magique, mais 1) Il faut les produire partir dembryons surnumraires. 2) En thorie Il faut faire autant de lignes quil y a de groupes Tissulaires (HLA) afin dviter le rejet de greffe: barrire immunologique Des CSE humaines sont en cours de dveloppement. Autre problme: risque de Tratomes. Mutations spontanes. Donc ncessit de Comprendre parfaitement les mcanismes molculaires de la diffrenciation

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LApplication majeure des CSE depuis 20 ans est en Recherche:

Invalidation de gnes (gene KO) par Recombinaison Homologue

et cration de Souris dans lesquelles les 2 allles dun gne sont casss . On analyse le rle dune protine par dfaut In Vivo (technique trs puissante). Exemples: Le gne codant pour le FT Ikaros est dlt: Les souris sont incapables De produire des lymphocytes. On en dduit que ce facteur est indispensable pour Que la CSH puisse se spcialiser en lymphocyte . Le KO du gne GATA1 limine lErythropose.etc Plus de 3000 gnes ont t ainsi invalids et leur vrai rle compris.

Comment Reprogrammer une Cellule

Les iPSC Clonage Thrapeutique Clonage Reproductif

Une Cellule peut elle Rajeunir ?

En thorie oui puisquune cellule somatique possde le mme gnome que L uf fcond. Mais depuis l uf une cellule a bloqu lexpression de certains gnes (cf htrochromatine etc) et a amplifi lexpression de certains autres, et plusieurs modifications ( Mthylation de lADN) (Actylation des Histones) etc, Epigntiques, ce sont produites. 3 Types de preuves:

1) Dolly: Le noyau dune cellule mammaire rimplant dans un ovule nucl est Reprogramm car la cellule Implante dans lutrus dune brebis donne naissance un animal identique la brebis donneuse: Clonage Reproductif. 2) Des CSM sont capables de Fusionner avec des cellules spcialises en culture Et in vivo: Des patients dcds qui avaient reu une greffe de moelle ont dans Leur myocarde des cardiomyocytes du donneur !
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3) Dfinition de conditions molculaires minimum pour transformer une cellule

Age en cellule de type embryonnaire.

Une quipe Japonaise dmontre que parmi 24 facteurs de Transcription, normalement exprims dans les CSE de souris, lintroduction de 4 dentre eux par transfert rtroviral dans des Fibroblastes de peau suffit transformer ces fibroblastes en cellules ayant les Proprits des CSE, dont la capacit reformer tous les tissus !! La mme quipe reproduit ces rsultats dans des cellules humaines en utilisant les 4 mmes gnes: Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4. (distance gntique souris-homme = Seulement 90 Millions dannes). On gnre ainsi des induced pluripotent SC , ipSC. Avenir: faire de lorgane autologue en culture: vite la barrire immunologique, mais Problmes techniques et cot: cest du cousu main et Qui va combler le dficit de la SS? Mais tout nest pas rsolu: 1) on ne peut pas modifier les cellules avec des rtrovirus. Il faudra utiliser des protines solubles ou des petites molcules. 2) Les cellules rajeunies vont-elles rexprimer la Tlomrase et rallonger les tlomres Des ex cellules ages ? : dure de vie des cellules ainsi obtenues. 3)Et si on injecte des cellules non totalement spcialises: risque de tumeurs ? Etc etc
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Autre possibilit thorique des CSE: Le Clonage Thrapeutique

Science Fiction
+ Cellule somatique

Ovocyte

Pseudo ovule

Transplantation de Cellules Autologues Muscle

Morula os

Blastocyste Mise en culture Mais on ne va pas in vitro plus loin que la morula dans lespce humaine. Risque dimplantation du pseudo uf dans un utrus: clonage Reproductif !!!!!
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Foie

FIN