Prof. Dr. Jos Luis da C.

Silva

REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Tcnica que permite a amplificao

da quantidade de DNA especfico

utilizando a enzima Taq DNA

polimerase, sequncias iniciadoras especficas (primers) e variaes de temperatura controladas.

COMPONENTE DA PCR
Reagentes

DNA

Taq polimerase Primers Tampo gua

dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotdeos)

Taq DNA polimerase

O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual uma bactria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

Taq DNA polimerase

Trata-se de uma enzima cuja atividade mantida durante 45 minutos a 95C. Sua quantificao dada em Unidades (U), sendo que cada U definida como a quantidade de enzima capaz de incorporar 10 nM de dNTP em cerca de 30 min a 72C.

Na maioria dos protocolos so utilizadas 2,0 a 2,5 U (0,5 l) de enzima em volume final de 100 l.
importante deixar claro que o excesso de enzima tambm pode prejudicar a eficincia da reao, podendo inclusive inibi-la.

Seqncias dos primers

Os primers (forward e reverse) devem ser construdos de acordo com a convenincia do investigador, de modo que esses possuam seqncias complementares a determinadas regies do DNA que limitam os segmentos a serem amplificados.

Desoxinucleotdios trifosfatados (dNTP)

So as bases nitrogenadas que constituiro as novas cadeias de DNA. Sua concentrao numa reao pode variar de 20 a 200 uM sendo importante que as quatro devam variar em concentraes equivalentes.

Quando esto em excesso (um nucleotdeo ou todos) podem ocorrer erros de incorporao de bases, gerando cpias alteradas

on magnsio
O on magnsio (Mg++) um co-fator enzimtico que desempenha um papel de extrema importncia na atividade da enzima Taq DNA polimerase. Sua concentrao em torno de 1,5 mM aplicvel a maioria das necessidades.

- Se a concentrao de Mg2+ muito baixa, temos pouco ou nenhum produto - Se a concentrao de Mg2+ muito elevada, a PCR tem baixa especificidade. Observa-se muitas bandas ou smear.

Smear

PCR Requerimentos
Cloreto de Magnsio: .5-2.5mM Tampo: pH 8.3-8.8 dNTPs: 20-200M

Primers: 0.1-0.5M
DNA Polimerase: 1-2.5 units

DNA Alvo: 1 g

ETAPAS DO PCR
DNA Taq polimerase Primers Tampo gua

dATP dCTP dGTP dTTP

(nucleotideos)

94C
DENATURAO

57C
ANELAMENTO

72C
EXTENSO

2. Alternncia de temperaturas (Termociclador) 25-40 (35) CICLOS

Amplificao de DNA (Plat)

Equao N=No2n

Reao: DNA Enzima Taq Primer Nucleotdeos Tampo gua

Anlise dos dados

Luz Ultravioleta

Fotodocumentao

Termociclador

Reao de PCR + Tampo Corado (Loading Buffer)

Eletroforese em gel de agarose + Brometo de Etdeo

FOTODOCUMENTAO DO GEL DE AGAROSE 2% UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb

600 400
400

600 400

100

100

100

100

Marcador de pares de base (pb)

TAMANHO ESTIMADO DOS FRAGMENTOS DE DNA AMPLIFICADOS

Variaes da tcnica de PCR

- Reverse Transcriptase -PCR (RT-PCR): amplifica RNAm,
construindo cpias complementares de DNA (cDNA). - Real Time-PCR: PCR quantitativo utilizado para determinao de carga viral. - Nested-PCR: amplifica seqncias de DNA de baixa frequncia (exemplo: diagnstico de parasitoses).

Aplicaes do PCR
A alta sensibilidade do mtodo de PCR, bem como a sua especificidade, nos permite amplificar uma seqncia-alvo mesmo a partir de amostras com baixo grau de pureza e de quantidades mnimas de DNA, o que torna o mtodo vivel no s para a pesquisa bsica mas tambm para a pesquisa aplicada.

Aplicaes do PCR
Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes utilidades/ aplicaes: 1. Deteco de delees / inseres determinadas pela gerao de produtos amplificados que apresentam alteraes em seu tamanho. Deteco de mutaces pontuais (substituio de bases), conhecidas ou no, que geram polimorfismos genticos podem ser determinadas pela ao das enzimas de restrio ou atravs do seqenciamento.

2.

Aplicaes do PCR
3.
4.

No diagnstico pr-natal ou pr-implantacional

(particularmente para doenas herdadas). Na tipagem para transplantes de rgos e susceptibilidade para doenas auto-imunes especficas (deteco de polimorfismo para HLA).

5.

No diagnstico e prognstico de doenas de ordem gentica, como o cncer, atravs do estudo dos genes relacionados a essas doenas.

6. 7.

Na medicina forense (DNA fingerprint). No diagnstico de doenas infecciosas por agentes patognicos diversos

Exerccios PCR
1) Vinte nanogramas de DNA genmico humano so necessrios para uma reao de PCR. O estoque do DNA tem uma concentrao de 0.2 mg DNA/mL. Quantos microlitros do estoque deveriam ser usados para 20 nanogramas? Um estoque de primer consistindo de dois primers necessrios para a PCR tem uma concentrao de 25 M. Que volume do estoque de primer deveria ser adicionado a 100 microlitros de reao para que a concentrao do primer na reao seja 0.4 M?

2)