Bio Molecular

Universidad Tecnolgica de la Selva
DR. SIGFRIDO DAVID MORALES FERNANDEZ TLAXCALA
INGENIERO AGRONOMO ESPECIALISTA EN FITOTECNIA (UNIVERSIDAD AUTONOMA CHAPINGO) MAESTRO EN CIENCIAS EN GENETICA (IREGEP, COLEGIO DE POSTGRADUADOS) DOCTOR EN CIENCIAS EN HORTICULTURA (INSTITUTO DE HORTICULTURA, UACH)
Redalyc: Desarrollo y rendimiento de papa en respuesta a la siembra de semilla-tubrculo inmadura. Revista Chapingo Serie Horticultura 17(1): 67-75.
BASES MOLECULARES DE LA VIDA
genoma
ADN
Clula
ADN
ARN PROTENAS
los genes contienen instrucciones para hacer protenas
cromosomas genes
ADN
protenas
las protenas actan solas o en complejos para realizar las funciones celulares
BIOINFORMATICA
Es el estudio de la informacin biolgica desde su almacenamiento en el genoma hasta la obtencin de los productos gnicos en la clula, esto involucra la creacin y desarrollo de tecnologas informticas y computacionales para la resolucin de problemas en biologa molecular.
Comprende los mtodos matemticos, estadsticos y computacionales que pretenden solucionar problemas biolgicos usando secuencias de ADN y aminocidos e informacin relacionada.
ENZIMAS USADAS EN BIOLOGIA MOLECULAR
Enzimas de restriccin
ADN polimerasa ADN ligasa Transcriptasa inversa (Taq polimerasa)
Polinucletido kinasa
Fosfatasa alcalina.
VECTORES DE CLONADO
Plsmidos Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosmico.
Los csmidos
Son vectores de clonacin, que han sido ampliamente usados en la elaboracin de genotecas de ADN econmicos de gran tamao, ya que permiten la introduccin de insertos de DNA de hasta 45 kb, el doble que los vectores derivados de la eliminacin de parte del genoma del fago, los fagmidos.
Virus Se emplea como vector, junto con la capacidad que poseen para introducir el ADN forneo en la clula hospedadora.
Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13 Para plantas: CaMV Para mamferos: SV40
MTODOS DE TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO
LA TRANSGNESIS
Se puede definir como la introduccin de ADN extrao en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las clulas en los organismos multicelulares.
Ingeniera Gentica SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENTICA Agrobacterium. Uso de la bacteria Como "Ingeniero Gentico". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las clulas de la planta produciendo la recombinacin gentica. Acelerador de Partculas (Gene Gun). Un can artificial bombardea micropartculas con el inserto, sobre la clula.
Ingeniera Gentica SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENTICA
Electroporacin. Uso de carga elctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear.
Polietilenglicol. Exposicin de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las molculas de ADN.
Silicon Wiskers. Inyeccin con fibras microscpi-cas, que atraviesan las membranas con los insertos.
Ingeniera Gentica SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENTICA MTODOS PARA LA TRANSFERENCIA DE GENES ESPECFICOS
A) Transferencia indirecta de genes Dicotiledneas Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes Virus Agroinfeccin
Monocotiledneas B) Transferencia directa de genes Transferencia de genes a los protoplastos (mediada qumica o elctricamente) Microinyeccin de DNA en los ncleos Fusin de protoplastos con liposomas que contengan DNA Transformacin por perdigonada
Macroinyeccin
Adems de las tcnicas de transferencia gnica basadas en el uso de Agrobacterium, existen otro tipo de tcnicas basadas en la utilizacin de tratamientos qumicos, fsicos y elctricos para introducir DNA en las clulas.
Estas tcnicas son denominadas transferencia gnica directa (DGT). comnmente como tcnicas de
Aunque la transferencia gnica mediada por Agrobacterium resulta efectiva en varias especies, las plantas monocotiledneas, incluidos los principales cereales (arroz, maz y trigo) no son transformadas fcilmente por Agrobacterium tumefaciens.
Estas dificultades en la transformacin de determinadas especies vegetales crean la necesidad de desarrollar otros procedimientos alternativos para la transferencia gnica. Comienza as el desarrollo de las tcnicas de transferencia gnica directa.
La incorporacin y expresin de DNA mediante protoplastos fue el primer mtodo de transferencia gnica que se demostr que funcionaba en las plantas. La tcnica se basa en el principio de que la pared celular es la principal barrera para la captacin de DNA, as que esta puede ser temporalmente extrada; posteriormente distintos mtodos simples pueden ser utilizados para la transferencia gnica.
La subsiguiente captacin de DNA a los protoplastos aislados puede ser efectiva mediante distintos mtodos fsicos y qumicos que van a crear poros en la membrana o bien mediante mecanismos de endocitosis que van a permitir el paso de molculas externas a travs de la membrana. El mtodo qumico ms efectivo es el mtodo que usa polietilen glicol (PEG) en combinacin con cationes divalentes (Ca++ o Mg++). El mecanismo de la captacin de DNA inducido por el PEG no est completamente entendido, pero implica la contraccin del volumen del protoplasto debido a la alta presin osmtica originada por el PEG, seguido de la creacin de vesculas endocticas que incorporan el complejo catin/DNA.
Las principales ventajas del mtodo de transformacin de protoplastos son que en los ensayos de expresin transitoria permiten la transformacin de un nmero muy elevado de clulas individuales, facilitando los ensayos cuantitativos con buenos niveles de replicacin.
Este mtodo tambin permite la produccin de muchas lneas independientes, la seleccin de microcayos derivados de protoplastos es eficiente y mediante la inmovilizacin de los protoplastos en sustratos como agarosa o alginato se pueden manipular con facilidad un gran nmero de cayos. Estos tributos permiten la seleccin de eventos que ocurren a muy baja frecuencia como la recombinacin homloga entre transgnes (Baur et al., 1990).
La principal limitacin del uso de estas tcnicas es que en muchas de las especies vegetales en las que se aplican de forma usual (aquellas especies recalcitrantes a la transformacin mediante Agrobacterium), la generacin de las plantas a partir de cultivos de protoplastos no es eficiente. Por esta razn, muchos laboratorios han elegido el uso de bombardeo de partculas como mtodo alterativo para la transferencia gnica, pues esta tcnica permite el uso de explantos multicelulares a partir de los cuales es ms fcil de regenerar plantas.
BOMBARDEO CON MICROPROYECTILES O BIOLSTICA Es el mtodo alternativo al plsmido Ti ms importante para transferir DNA a plantas. La tcnica consiste en baar partculas esfricas de oro o tungsteno (aproximadamente de 0.4-1.2 micrmetros de dimetro, o del tamao de algunas clulas bacterianas) con DNA, el cual ha sido precipitado con CaCl2, espermidina o polietilen glicol.
Las partculas baadas con DNA son aceleradas a altas velocidades (300-600 metros / segundo) con un equipo especial llamado pistola de partculas (o pistola de genes). La versin original de esta pistola de partculas utilizaba una pequea cantidad de plvora para acelerar las micropartculas.
Actualmente se usa helio a altas presiones como fuente para la propulsin. Los proyectiles acelerados van a penetrar la pared celular y la membrana de la clula, aunque la densidad de partculas utilizadas no va a resultar significativamente daina para la misma. El alcance de la penetracin de las partculas en las clulas vegetales puede ser controlada variando la intensidad del estallido, alterando la distancia que las partculas han de atravesar para alcanzar la clula o utilizando partculas de diferentes tamaos.
Una vez dentro de la clula, el DNA se separa de las partculas y, en algunos casos, es integrado dentro del genoma de las plantas. El bombardeo con microproyectiles es utilizado para transferir DNA exgeno a suspensiones celulares de plantas, a cultivos de callos, a tejidos meristemticos, a embriones inmaduros y a polen, todos ellos obtenidos a partir de un amplio rango de plantas diferentes, incluidas monocotiledneas y confieras, plantas menos susceptibles de la infeccin por Agrobacterium. Adems, este mtodo a sido utilizado para transferir DNA a cloroplastos y mitocondrias.
De forma convencional, los plsmidos de DNA disueltos en tampn son precipitados sobre la superficie de los microporoyectiles. Este procedimiento tiene como objetivo aumentar la frecuencia de clulas transformadas al aumentar la cantidad de plsmido de DNA; no obstante, una elevada cantidad de plsmido puede resultar inhibitoria. Se estima que aproximadamente 10,000 clulas son transformadas con cada bombardeo. Con esta tcnica, las clulas transformada, que son detectadas por la expresin de unge marcador, a veces solo expresan el DNA transferido de forma transitoria.
El mtodo de bombardeo de micropartculas es una de las tcnicas de transferencia gnica ms importante, ya que por su naturaleza totalmente fsica, es independiente del tipo de clula blanco y ha sido utilizado no slo para introducir ADN exgeno a clulas vegetales, sino a clulas de una gran variedad de organismos tales como bacterias, algas, hongos, clulas animales, y an animales y plantas intactas.
La biobalstica ha sido utilizada con xito para producir plantas transgnicas a partir de una gran variedad de tejidos vegetales, entre los que se incluyen hojas, meristemos, embriones en desarrollo, embriones maduros, callos embriognicos, suspensiones celulares. Los principales logros en la obtencin de plantas transgnicas por medio de este mtodo, incluyen especies de gran inters econmico como son la soja, maz, arroz, sorgo, papaya, caa de azcar, trigo y esprrago. Tambin se ha utilizado para transformar microorganismos como levaduras, el moho Aspergillus y el alga Chlamydomonas.
Esta metodologa de transformacin tiene ciertas limitaciones, ya que algunos tejidos oponen una resistencia natural a la penetracin de las partculas, dada por cutculas endurecidas, paredes celulares lignificadas o superficies vellosas. Sin embargo, los principales limitantes del mtodo continan siendo la baja relacin entre el total de clulas sometidas al bombardeo y el nmero de clulas que logran incorporar de manera permanente la informacin gentica transferida.
MICROINYECCIN
La transformacin estable va inyeccin de DNA en el ncleo celular (Jaenisch & Mintz, 1974) es una tcnica que ha sido aplicada en clulas animales desde hace ya veinte aos, convirtindose en el mtodo de transferencia gnica ms utilizado, sobre todo en mamferos.
La microinyeccin ofrece la ventaja de que es uno de los dos mtodos, junto con la transformacin mediada por lser, que permite la transferencia gnica a una clula concreta. La clula continuar su desarrollo y el transgn expresado lo har tambin en su progenie. Esto constituye una poderosa herramienta para analizar la expresin gnica diferencial en distintos tipos celulares y para el marcaje de clulas en el estudio de morfognesis vegetal.
En plantas la aplicacin de la microinyeccin resulta ms difcil que en animales y , aunque se han hecho importantes avances en la aplicacin de esta tcnica en clulas vegetales, su uso continua resultando muy complicado.
La principal dificultad que se encuentran en plantas es la presencia de pared celular, la cual no es solo una barrera fsica que hace necesario el uso de capilares mucho ms gruesos para llevar a cabo la microinyeccin, sino que tambin dificulta mucho la visualizacin del ncleo, lo que hace que la microinyeccin tenga lugar muchas veces en el citoplasma. Otro problema es la presencia de grandes vacuolas en las algunas clulas vegetales, pues si el DNA es transportado a su interior, este ser degradado antes de alcanzar el ncleo.
En los primeros estudios, la dificultad de atravesar la pared celular para llevar a los investigadores a utilizar sistemas de protoplastos. A mediados de los aos ochenta, se consigui llevar a cabo la transformacin de tabaco y alfalfa va microinyeccin de protoplasto con el plsmido de DNA de Agrobacterium (Cossway et al., 1986; Reich et al., 1996). Un ao despus, consigui llevarse acabo de forma exitosa la microinyeccin de cromosomas aislados (Griesbach et al., 1987; de Laat and Plaas, 1987).
Aunque en principio la transformacin de clulas mediante microinyeccin ocurre solo de manera transitoria, al menos en clula tisulares, se a observado que las clulas de la lnea germinal transformadas son capaces de generar plantas (Simmond et al., 1992) y la inyeccin en polen funciona en la fertilicin in vitro (Kranz & Loerz, 1990).
A pesar de que la microinyeccin es una de las tcnicas de transferencia gnica ms precisa, pues permite introducir el DNA en compartimentos intracelulares especficos, las dificultades de su aplicacin hacen que hoy en da, no se plantea la aplicacin de la microinyeccin como una tcnica de transformacin rutinaria, aunque si puede utilizarse para la introduccin de DNA en determinadas clulas.
MACROINYECCIN La trasformacin mediante la inyeccin de DNA en el interior de cavidades que contienen meristemos u rganos sexuales de la planta parece ser un paso obvio para la introduccin de DNA en la planta. Esta tcnica ofrece la oportunidad de un mayor y ms ntimo contacto entre el DNA y la lnea germinal.
La metodologa de esta tcnica es sencilla; la solucin que contiene el plsmido de DNA ser inyectado en la cavidad que rodea la inflorescencia en desarrollo. El inconveniente es que ser necesario utilizar una gran cantidad de plsmido. La potencial ventaja de esta tcnica es por tanto su simplicidad, ya que puede ser utilizada en todas las plantas sin necesidad de la preparacin de cultivos tisulares.
En los primeros estudios llevados a cabo, se utiliz DNA genmico de plantas que contena genes cuyo efecto poda ser valorado morfolgicamente. Algunos estudios afirmaron la transformacin, mientras otros dieron resultados negativos, como consecuencia de la difcil interpretacin de los resultados a causa de las contaminaciones que pueden ocurrir cuando se utilizan genes marcadores naturales de la planta.
El inters en esta tcnica aument en 1987 cuando se consigui la transformacin del centeno mediante la inyeccin de DNA en el floral tiller (de la Pena et al., 1987). En este trabajo, se utiliz el gen de la neomicina fosfotransferasa como marcador y la evidencia de la transformacin se basaba en la seleccin con kinamicina y el anlisis por Southern, aunque la transmisin a la progenie no pudo ser confirmada.
Se realizaron tambin experimentos con cebada, en la que se consigui llevar a cabo la transferencia del gen GUS (Rogers & Rogers, 1992), aunque no se encontraron evidencias moleculares claras de la transformacin.
Aunque los distintos experimentos llevados a cabo sugieren que no se puede descartar esta tcnica como un mtodo de transformacin funcional, lo cierto es que actualmente no existen evidencias de que la macroinyeccin sea una tcnica reproducible para la transformacin de plantas.
ELECTROPORACIN
El principio de esta tcnica de transformacin se basa en el conocimiento de que la aplicacin en la membrana celular de pulsos elctricos cortos y de alto voltaje hace que en esta aparezcan, de forma temporal, poros que van a permitir la entrada en el interior de la clula de macromolculas presentes en la solucin extracelular (Neumann & Rosenheck, 1972).
Los poros van a crearse en el componente lipdico de la membrana, por lo que tras el tratamiento, la membrana volver a su estado normal. Este proceso permite a las clulas suspendidas en un tampn con plsmidos de DNA incorporar al interior celular el ADN tras la electroporacin, resultando en una trasformacin transitoria o estable. Inicialmente, la aplicacin de la electroporacin como mtodo de transformacin fue desarrollado en bacterias, levaduras y sistemas animales.
La electroporacin es un mtodo relativamente sencillo, aunque su aplicacin a protoplastos es relativamente difcil, como consecuencia de las limitaciones tcnicas que supone el cultivo y la regeneracin de protoplastos. No obstante, est tcnica comenz a utilizarse ya a principios de los ochenta, asumiendo de forma general que la pared celular no es permeable a macromolculas del tamao de los cidos nucleicos, por lo que se requera un tratamiento con pectinasas.
Posteriormente se aplic a protoplastos de plantas como una alternativa a los procesos de captacin de DNA exgeno inducidos qumicamente.
El polen y las microsporas son clulas que en principio resultan adecuadas para la electroporacin, pues son clulas sencillas, totipotentes por definicin. Tras la electroporacin, existen dos mtodos para la obtencin de las plantas transgnicas: la induccin de la andrognesis in vitro y la utilizacin del polen transgnico para la fertilizacin normal de las plantas.
Tras los estudios iniciales que demostraron la viabilidad de la transferencia gnica mediante electroporacin, Dereck et al (1990) aplicaron esta tcnica a tejidos obtenidos a partir de las hojas de arroz, maz, trigo y cebada. El estudio demostr que era posible la transferencia gnica a clulas intactas organizadas en tejidos. Estos estudios suscitaron el inters en el potencial de la electroporacin para la transformacin de especies de cultivo no susceptibles a la transformacin con Agrobacterium.
La obtencin de plantas transformadas de forma estable a partir de tejidos sometidos a electroporacin se consigui por primera vez en arroz (Li et al., 1992); poco despus se consigui en maz, posteriormente, se consiguieron plantas transgnicas de caa de azcar mediante la electroporacin de meristemos basales (Arencibia et al., 1992) as como plantas de maz transformadas a partir de suspensiones celulares (Laursen et al., 1994).
Otras tcnicas son:

ULTRASONIDOS TRANSFORMACIN GNICA MEDIANTE LSER TRANSFORMACIN MEDIADA POR POLEN TRANSFERENCIA GNICA POR INBIBICIN
ADN RECOMBINANTE, CLONACION DE GENES
Feliz da de la mujer
El proceso de obtencin de DNA recombinante se puede resumir en las siguientes etapas:
Aislar y fragmentar el DNA del organismo del cual se quiere clonar un gen. Unir ese DNA a un vector, que va a servir de vehculo para transportar el DNA de inters a un organismo, generalmente bacterias, con una alta tasa de reproduccin, para obtener una amplificacin del DNA recombinante, en esta etapa se obtienen clones. El siguiente paso es la seleccin del clon que contiene el gen de inters. En una etapa posterior, se debe realizar el anlisis del gen clonado.
ETAPAS BSICAS PARA LA OBTENCIN DE ADN RECOMBINANTE
Preparacin del inserto de ADN a clonar Preparacin del vector Unin del fragmento de ADN al vector Introduccin del ADN recombinante en una clula anfitriona Propagacin celular y seleccin del clon con el gen de inters Anlisis del gen clonado
HERRAMIENTAS DE LA TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE
ENZIMAS Enzimas de restriccin Taq ADN polimerasa Ligasas
VECTORES
Plsmidos Virus
PREPARACIN DEL INSERTO DE ADN
I.
Amplificacin de ADN mediante PCR (reaccin en cadena de la polimerasa)
II.
Aislamiento y fragmentacin del ADN
PCR
Repeticin de tres etapas Desnaturalizacin del ADN (94C) Unin especfica de los cebadores (50-60C) Extensin por ADN polimerasa (72C)
PCR
ADN molde ADN polimerasa termoestable Taq polimerasa de Thermus aquaticus Cebadores: Oligonucletidos 10-20 pb Desoxirribonucletidos trifosfato (dATP,dTTP,dCTP,dGTP) Magnesio Termociclador
ANLISIS DEL PCR Electroforesis Tincin
Gel
Bromuro de etidio
300pb
Transiluminador de luz UV
APLICACIONES DE LA PCR
Diagnstico precoz de enfermedades genticas Deteccin de enfermedades vricas Medicina forense y criminologa Estudios evolutivos y Arqueologa molecular Anlisis de alimentos Deteccin de patgenos Identificacin de especies Deteccin de transgnicos
II. AISLAMIENTO DE ADNg A PARTIR DE EXTRACTO CELULAR
Lisis celular (SDS, EDTA, ARNasa) Extraccin de protenas y lpidos Tratamiento con fenol-cloroformo Recuperacin del ADN Precipitacin con etanol en presencia de sales
PURIFICACIN DEL ADNg A PARTIR DEL EXTRACTO CELULAR
Fenol-Cloroformo Centrifugacin Extracto celular
Fase acuosa: ADN y ARN Interfase: Protenas Fase orgnica: lpidos y protenas
Etanol + sales Centrifugacin DNA puro
DNA precipitado
VECTORES
CARACTERISTICAS
Capaces de replicar en la clula anfitriona De pequeo tamao De clonacin o de expresin
TIPOS PLSMIDOS BACTERIFAGOS CSMIDOS
Las enzimas de restriccin son endonucleasas que cortan el DNA en sitios especficos, cuando encuentran una secuencia de nucletidos determinada, se conocen ms de 100 enzimas diferentes, cada una de ellas con un sitio de reconocimiento distinto. Constituyen una herramienta de gran precisin imprescindible para fragmentar el DNA por sitios fijos; permiten, por tanto, cortar el DNA en fragmentos de manera especfica, controlada y reproducible.
Las enzimas de restriccin se suelen nombrar con las iniciales de la bacteria de la que se asla, seguida de alguna inicial de la cepa o nmero si existiera ms de una. As por ejemplo, la EcoRI procede de la Escherichia coli cepa RY 13. Las enzimas de restriccin pueden cortar de manera asimtrica el DNA (por ejemplo EcoRI) produciendo fragmentos de DNA con extremos protuberantes o cohesivos.
Otras enzimas en cambio realizan un corte simtrico en ambas cadenas de ADN produciendo extremos romos, por ejemplo Sma I.
ENZIMAS DE RESTRICCIN A-A-T-T-C...... G...... ......G ......C-T-T-A-A A-G-C-T-T...... A...... ......A ......T-T-C-G-A-A
EcoRI Escherichia coli
......G-A-A-T-T-C...... ......C-T-T-A-A-G......
HindIII Hemophilus influenzae
......A-A-G-C-T-T...... ......T-T-C-G-A-A......
Sma I Serratia marcescens
......C-C-C-G-G-G...... ......G-G-G-C-C-C...... ......C-C-C ......G-G-G
G-G-G...... C-C-C......
FRAGMENTAR EL ADN ADN con el gen de inters Vector
Sitio de corte nico
Sitio de corte
Enzima de restriccin
Enzima de restriccin
UNIN DEL ADN AL VECTOR: LIGACIN
ADN digerido con enzima X o producto de PCR vector digerido con enzima X o vector T
Ligasa
LIGASAS
RESULTADO DE LA LIGACIN
Fragmentos de ADN Molculas del vector no ligado no ligado
Molculas del vector religado
ADN recombinante que no contiene el gen de inters
ADN recombinante con el gen de inters
INTRODUCCIN DEL ADN RECOMBINANTE EN CLULAS ANFITRIONAS: TRANSFORMACIN
Alteracin transitoria de la permeabilidad celular: clulas competentes Tratamientos qumicos Cloruro de calcio, cloruro de rubidio Aadir la mezcla de ligacin Tratamiento trmico Otros procedimientos de transformacin Electroporacin Biovalstica Microinyeccin
TRANSFORMACIN EN BACTERIAS
Plsmido CaCl2 42C, 2min
Clula bacteriana normal
Clula bacteriana competente
Clula transformada
OBTENCIN DE CLONES
Las clulas se cultivan en un medio slido selectivo (placas con antibitico, sustrato) Cada clula se multiplica y forma una colonia o clon Todas las clulas de un clon son idnticas En el interior de cada clula, el vector con el fragmento de ADN exgeno se replica
RESULTADO DE LA TRANSFORMACIN
Clulas con el vector religado
Clulas con ADN recombinante Clulas con ADN recombinante con el gen de inters que no contiene el gen de inters
BIBLIOTECAS DE DNA Puesto que cada segmento de DNA clonado es relativamente pequeo, deben construirse muchos clones diferentes para incluir todas las pequeas porciones del genoma de un organismo. El conjunto clonado de todas las secuencias genmicas de un slo individuo se denomina biblioteca. Las bibliotecas clonadas pueden provenir del genoma completo de un individuo, del DNA de un solo cromosoma, o del conjunto de genes transcripcionalmente activos en un nico tipo celular.
Construccin de una biblioteca Se seleccionan regiones organismo deseado. Las regiones apropiados. son del DNA de un
clonadas
en
vectores
Se obtiene una coleccin de clones que incluyen el genoma total del organismo.
BIBLIOTECA DE ADNg Conjunto de clones recombinantes en representado todo el ADN de un organismo BIBLIOTECA DE ADNc Conjunto de clones recombinantes obtenidos a partir de los ARNs mensajeros de un organismo o tejido determinado Facilita la clonacin de genes de organismos superiores Facilita la expresin de genes de organismos superiores en procariotas porque elimina los intrones el que est

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