INTRODUCCIN AL USO DE MARCADORES MOLECULARES PARA CARACTERIZACIN DE BIODIVERSIDAD

GENMA, GEN Y ADN RECOMBINANTE

JOS ROBERTO ALEGRA COTO Depto. de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico

ralegria@conacyt.gob.sv

San Andrs, CENTA Auditorio 2 R. ALEGRA

CONACYT 2002

Martes 10 de Diciembre 2002.

CONTENIDO:
OBJETIVO
Presentar informacin bsica de manera comprensible sobre la Biologa Molecular y sus aplicaciones tcnicas.

INTRODUCCIN GENMA Y GEN ADN RECOMBINANTE

Tcnicas del ADN recombinante Modelos Vegetales Nuevas: protenas, plantas, animales, alimentos, frmacos Biotecnologas promisorias

AVANCES HISTRICOS DE BIOLOGA MOLECULAR

1941 Genes codifican las protenas 1944 Prueba que el ADN porta la informacin gentica 1953 Determinacin de estructura del ADN 1961 Cdigo Gentico, ARN mensajero, regulacin gnica 1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa 1970 Smith y colegas aislaron y caracterizaron la Hind III 1972 Janet Mertz y Ron Davis cortaron y pegaron mol de ADN 1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias 1974 Demostracin directa de deleccin gnica humana 1975 Southern Blotting 1977 Fred Sanger secuenci el virus de ADN X174 1978 Biblioteca gnica humana 1979 RFPL para diagnstico prenatal, oncogenes celulares
R. ALEGRA CONACYT 2002

1979-81 genes humanos clonados y secuenciados 1982 Tabaco, la primera planta modificada genticamente 1983 Kary Mullis concibe el PCR / Fred Sanger y colegas 1986 1987 1995 1996 1998 1999 2000 2000 2001
publican la secuencia del lambda La secuenciacin del ADN es automatizada Inicia el Proyecto del Genoma Humano Es secuenciado la bacteria Haemophillus influenzae Es secuenciada la levadura Saccharomyces cerevisiae Es secuenciado el nemtodo Caenorhabditis elegans Es secuenciado el cromosoma 22 humano Es secuenciada la mosca de la fruta D. melanogaster / 26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano 14 de dic. secuencia de Arabidopsis thaliana 26 de enero borrador genma del arroz Oriza sativa

AVANCES HISTRICOS DE BIOLOGA MOLECULAR

R. ALEGRA CONACYT 2002

Transferencia de genes en animales

BIOTECNOLOGA
Cultivo de Clulas Vegetales Diagnsticos

Frmacos Anti-cncer

Solucin de crimenes Tecnologa del ADN Bancos de ADN, ARN Protenas Mapas de Genomas completos

Biologa Molecular
Ingeniera Gentica
Sntesis de Nuevas Protenas Nuevas Plantas y Animales Nuevos Alimentos Nuevos Antibiticos Clonacin Produccin de Protenas humanas Recursos humanos qumicos raros Terapia Gnica

Marcadores

Sntesis de Sondas de ADN

Localizacin desrdenes genticos

Tecnologa del ADN

GENMICA

Es el estudio del genoma y su accin.

IBM SP Supercomputadora

El genoma es la suma total del material gentico presente en un organismo particular, incluye el ADN presente en los cromosomas y en los organelos subcelulares (ej., mitocondrias) y el genoma de ARN de algunos virus.
El anuncio el 26 de junio de 2000, del borrador del genoma humano en un 90%, marc un hito histrico para la humanidad.

Tecnologa del ADN: GENMICA

Mtodos utilizados en la genmica incluyen:

Genmica Estructural. Estudio de que secuencias de

genes estn presentes dentro del ADN de un organismo. Genmica Funcional. El estudio de que funciones son conferidas a un organismo por una secuencia gnica dada. Genmica Qumica. Se usa para comparar dos organismos de la misma especie (uno de los cuales tiene un gen o genes inactivados por un qumico especfico o una mutacin puntual. Anlisis de la Expresin Gnica. Se usa para determinar el producto o productos producidos (tales como una enzima u otra protena crtica). Cuando un determinado gen es activado, se mide la fluorescencia de las molculas de ARN mensajero (ARNm) individual, cuando este ARNm hibridiza (con piezas de ADN correspondientes a las protenas producidas/analizadas, que estn adheridas a la superficie de hibridizacin sobre un biochip).

El genoma de un organismo es el juego completo de ADN. La planificacin del Proyecto Genoma Humano se inici en 1986, previsto para el 2007. En Junio de 2000 se present el 90% del borrador con la secuenciacin de unos 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Los genes son secuencias especficas de bases que codifican instrucciones para hacer protenas. Los genes son un 2% del genoma humano.
Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2% 60% De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de Drosophila.

GENOMAS

Tecnologa del ADN

IDENTIDAD GENTICA
70%

20%

95% idntico

Humanos 30,000 genesALEGRA R.

Chimpanc 30,000 genes

Ratn 30,000 genes

A. thaliana 25,000 genes

C. elegans 19,000 genes

D. melanogaster 13,000 genes

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Tecnologa del ADN:

GENOMAS VEGETALES

El 14 de diciembre de 2000, se present la secuencia del genoma completo de la primera especie vegetal la Arabidopsis thaliana. El 26 de enero de 2001, el borrador de la secuencia del arroz (Orizae sativa). El funcionamiento de los genes en el arroz se aplicara a cultivos principales, tales como trigo (Triticum spp) y maz (Zea mays) con genomas mas grandes y ms dificiles de secuenciar. El arroz es el genoma mas simple y pequeo de los genomas de todos los cereales, tiene 50,000 genes, dos veces el de Arabidopsis, y 12 cromosomas comparado con cinco de

Arabidopsis.

Tecnologa del ADN:

GENOMAS VEGETALES

Microarreglo o Biochip con secuencias de 11.500 genes hibridados con

ARNm de Arabidopsis thaliana obtenidas antes (fluorescencia verde) y despus (fluorescencia roja) del ataque del hongo Erysiphe cichoracearum. Las flechas indican genes que se han expresado en respuesta al patgeno. Un punto rojo significa expresin incrementada, un punto amarillo igual expresin, uno verde expresin disminuida y uno negro ausencia de expresin. Unos 70a genes han variado su nivel de expresin luego del ataque del patgeno. La informacin ser usada para comprender los mecanismos de defensa involucrados. El anlisis se realiza mediante computadoras que identifican los genes candidatos y proveen toda la informacin disponible sobre los mismos. El microordenamiento ha sido impreso en vidrio cuyo tamao real es de 22 x 40mm. El inserto muestra una ampliacin de tres bloques del R. ALEGRA microordenamiento conteniendo 360 CONACYT 2002 genes cada uno (www.cienciahoy.org)

Tecnologa del ADN:

GENOMAS VEGETALES

La Compaa SYNGENTA (suiza), ha demostrado la utilidad de la genomica al utilizar la secuencia QTL 21 del cromosoma 1 del genoma del maz (el cual fomenta la produccin de la planta), encontrando un arreglo y orden de genes bastante similar con el existente en la variedad japonica o Nipponbare del arroz que ellos secuenciaron. Pamela Ronald, Fitopatloga Vegetal de la Universidad Davis de California, usando una secuencia de la variedad de arroz indica, secuenciada por el Instituto de Genmica de Beijing y el Centro de Genoma de la Universidad de Washington, identific un gen de resistencia a las enfermedades en arroz, cuya caracterstica fenotpica ha sido usada por cientos de aos por los fitomejoradores sin conocer su procedencia gentica.
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Tecnologa del ADN: GENMICA FUTURA

En la 14th International Genome Secuencing and Analysis Conference (oct. 2002), US Genomics Inc., present un aparato que lee la doble hlice de ADN sin cortarlo. Abre la doble hlice espiral de ADN, la lineariza y la pasa por un escaner para leerla en un lector fijo (como una plicula de carrete pasa por un proyector), las molculas se mueven a 30 M de bases por minuto. En 40

minutos se pueden Leer 3 mil M de bases.

Si el sistema se logra pasar a un biochip el tiempo bajar a menos de cinco minutos, por la habilidad de capturar un Terabyte (1024 o 1000 gigabites, un gigabite = 1024 o 1000 Megabites) de informacin cada pocos segundos.(Uehling, M. D, BioIt World Nov. 12 2002).

BASES MOLECULARES genoma DE LA VIDA

Clula cromosomas genes

ADN ARN

ADN

PROTENAS
los genes contienen instrucciones para hacer protenas

ADN

protenas

las protenas actan solas o en complejos para realizar las funciones celulares

ESTRUCTURA DE UN GEN
Tradicionalmente, un gen se ha definido como un segmento de ADN que codifica para un polipptido o para una molcula funcional de ARN.

Molcula de ADN

Recientemente, los nuevos descubrimientos han alterado radicalmente esta visin, para adoptar una definicin ms vaga. De acuerdo con ello, un gen es una secuencia de ADN genmico o de ARN que es esencial para especificar una determinada funcin. Para llevar a cabo su funcin el gen no necesita ser traducido a protena, y a veces ni siquiera necesita R. ALEGRA CONACYT 2002 ser transcrito.

ESTRUCTURA DE UN GEN
Elementos tpicos: 1) regin reguladora o promotor basal (caja TATA). o sitios de unin de proteinas reguladoras (upstream promoter). o Realzadores (enhancers) o Silenciadores

2) sitio de inicio de transcripcin.

3) 5'UTR. 4) codn de inicio. 5) intrones y exones alternados, con sitios de procesamiento aceptores y donadores 6) Codn de paro. 7) 3'UTR.

8) seal de poli-adenilacin.

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ESTRUCTURA DE UN GEN
Los promotores pueden ser genricos o tejido especfico

Promotores Sitio de inicio de la Transcripcin Exones Intrones

Realzadores Sitio de terminacin de la Transcripcin

< 100 Kb

La funcin del gen depende de los FACTORES de TRANSCRIPCIN (FT) que activan a las ARN pol. Los FT son: los Factores de Transcripcin General (se unen a secuencias promotoras genricas) y los Activadores de Transcripcin (se unen a secuencias promotoras especficas). Los FT pueden activarse o desactivarse en respuesta a estmulos del entorno del organismo.

INGENIERA GENTICA O ADNr

La Ingeniera Gentica o tecnologa del ADNr se inici en la dcada de los 70s. Se refiere a un grupo de tecnologas usadas para cambiar la composicin gentica de las clulas y mover genes a travs de las fronteras de las especies para producir nuevos organismos. Se pueden aislar genes, modificarlos, introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos para obtener una ventaja novedosa sobre el organismo natural.

INGENIERA GENTICA: TCNICAS

DEL ADN RECOMBINANTE (ADNr)

TCNICA Enzimas de Restriccin ADN Ligasa Vectores Plasmidos PROPSITO Cortan ADN en puntos especficos, hacen fragmentos de ADN Une fragmentos de ADN Virus o fagos: llevan ADN a las clulas y aseguran replicacin Clase comn de vector

Marcadores Genticos
PCR ADNc Sondas de ADN Sntesis Gnica Gel Electroforsis Secuenciacin de ADN

Identifican a las clulas que han sido transformadas

Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeas Hace una copia de ADN de ARN mensajero Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta secuencia Para hacer un gen de una base de datos Para separar fragmentos de ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN

TCNICAS DEL ADNr: ENZIMAS

PARA LA MANIPULACIN DEL ADN

Enzimas de restriccin ADN polimerasas ARN polimerasas Nucleasa ADN ligasa Kinasa Fosfatasa Transcriptasa reversa
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Tcnicas del ADNr: SISTEMAS

DE TRANSFERENCIA GENTICA
1. Agrobacterium. Uso de la bacteria Como "Ingeniero Gentico". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las clulas de la planta produciendo la recombinacin gentica. 2. Acelerador de Partculas (Gene Gun). Un can artificial bombardea micropartculas con el inserto, sobre la clula. 3. Electroporacin. Uso de carga elctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. 4. Polietilenglicol. Exposicin de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las molculas de ADN. 5. Silicon Wiskers. Inyeccin con fibras microscpicas, que atraviesan las membranas con los insertos.
R. ALEGRA CONACYT 2002

Tcnicas del ADNr: SISTEMAS

DE TRANSFERENCIA GENTICA
6. Microinyeccin. Una clula es adherida a una pipeta bajo un microscopio y el ADN forneo es inyectado directamente en el ncleo usando una micropipeta muy fina. Se usa cuando hay pocas clulas disponibles, tales como clulas fertilizadas de huevo animal. 7. Liposomas. Los vectores pueden ser encapsulados en pequeas vesculas de membrana para introducir el ADN in vivo en la clula.
R. ALEGRA CONACYT 2002

Tcnicas del ADNr: SISTEMAS

DE TRANSFERENCIA GENTICA
En 1999 se usaron agujas de vidrio huecas con puntas de 1m de dimetro, bajo la gua de un microscopio para inyectar ADN directamente en cloroplastos. Dichas puntas finas no daan la membrana del cloroplasto, pero es requerida una alta presin para sacar el ADN de la aguja. El control del flujo de ADN bajo alta presin es un problema prctico significativo, que ha sido superado introduciendo un metal lquido en la aguja atrs del ADN. Cuando la aguja es calentada el metal se expande forzando al ADN a salir de manera controlada. Los investigadores tambin han usado esta misma tcnica para introducir ADN en bacterias individuales y ncleos de clulas eucariticas (www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/DNA/PDF/DNA 01).

Ingeniera Gentica:

MODELOS VEGETALES Las plantas que se usan como modelos de aprendizaje en Ingeniera Gentica Vegetal son: Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum (tabaco), Orizae sativa (arroz) y Solanum tuberosum (papa).
Estos modelos son tiles para aprender haciendo y ayudar a resolver problemas identificados por los agricultores nacionales, mientras se capacitan los miembros de los Centros o Unidades de Investigacin que se quieran preparar.
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Ingeniera Gentica NUEVAS PLANTAS

ARROZ con altos niveles de tolerancia a

diferentes condiciones ambientales de estrs. Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa de E. Coli y un promotor tejido especfico dependiente del estrs. Los genes de trehalosa permiten la produccin de arroz an si est estresado por frio, sequa o altos niveles de salinidad e incrementa la produccin en 20%. La composicin qumica de los granos no cambia. El azcar trehalosa ayuda a estabilizar molculas biolgicas: lpidos, enzimas y otras protenas, en organismos en condiciones de estrs (PNAS Online, 27 nov. 2002).

Ingeniera Gentica NUEVOS ANIMALES

1987 secrecin de Beta-lactoglobulina en leche de ratn.

Produccin de protena C humana en leche de cerdos, para desrdenes como hemofilia. Hormonas de crecimiento humano en tejido seminal de cerdo.
Antitrombina humana III, anticoagulante sanguneo secretada en leche de cabras transgnicas. Cabras transgnicas para producir BioSteel fibra hecha por el hombre con propiedades de tela de araa.

Ingeniera Gentica NUEVOS ALIMENTOS Salmn transgnico por

hormona de crecimiento. Producido por AF Protein Inc. cuenta con el promotor de la protena de anticongelamiento de otra especie de pez. Crece de 4 a 6 veces ms rpido que un salmn no transgnico. Tiene un 20% en mejoramiento de la eficiencia de conversin del alimento. (ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

ARROZ DORADO con beta caroteno de

genes de narciso y de Erwinia uredovora, pigmentos que se transforman en provitamina A al ser ingeridos. ARROZ fortificado con un gen de la ferritina.

ARROZ con aa esenciales.

Ingeniera Gentica NUEVOS FRMACOS

PAPA con la vacuna que previene la insulina dependencia de la diabetes mellitus 100 veces ms poderosa que la actual vacuna. PAPA con la sub-unidad B antignica de la enterotoxina del Vibrio cholerae causante del clera). FRIJOL de SOYA con anticuerpos que protegen contra el virus 2 de Herpes simplex (HSV). TABACO con anticuerpos que previenen la caries dental producida por

Streptococcus mutans.

Ingeniera Gentica

CLONACION

Trmino genrico para la replicacin en un laboratorio de genes, clulas u organismos de una entidad original, con copias genticas exactas del gen, clula u organismo original. Esta tcnica ha producido avances sensacionales en medicinas y vacunas. Tambin hay investigacin en clonacin de clulas humanas, rganos y otros tejidos. Esto puede producir el reemplazo de piel, cartilagos y hueso para victimas de quemaduras y R. ALEGRIA CONACYT 2002 accidentes, o de rganos.

BIOTECNOLOGAS PROMISORIAS
Entre las Biotecnologas promisorias para el desarrollo productivo de El Salvador estn: i) Tecnologas Moleculares para diagnstico de enfermedades infecciosas, ii) Bioinformtica, iii) Genmica, iv) Modificacin Gentica de Cultivos, v) Tecnologas recombinantes para hacer productos terapeticos, vi) Bioremediacin, vii) Qumica combinatoria (COMBICHEM) , viii) Bio-nanotecnologa.
(Top 10 Biotechnologies for Improving Health in Developing Countries: www.utoronto.ca/jcb)

www.conacyt.gob.sv

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION

Atentamente:

ROBERTO ALEGRIA ralegria@conacyt.gob.sv