UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA Centro de Cincias Biolgicas Departamento de Microbiologia e Parasitologia Microbiologia Geral Prof Admir Jos

Gianchini

MTODOS DE AVALIAO DA DIVERSIDADE MICROBIANA

Alceu Alves Azambuja Aline Zanini Carpes Andre Buitoni Lais da Silva Bellettini

http://www.piauinet.com.br/ciencia/

Biogeografia
- O que ? - Se aplica a microorganismos?

Diversidade
- Riqueza - Equilbrio

A biodiversidade de plantas e animais so grandemente conhecidas e estudadas, enquanto a diversidade de microorganismos , na sua maior parte, desconhecida. Microorganismos apresentam riqueza em diversidade molecular e qumica, visto que eles esto na base de processos bsicos do ecossistema.
H somente 1,7 milho de espcies descritas.

Porque estudar a diversidade microbiana? So muito utilizados para

Produo de alimentos; Bebidas; Fertilidade do solo; Biotecnologia; etc

Alm das vrias utilidades nas nossas indstrias, conhecendo os microorganismos possvel conhecer e resolver doenas.

Mtodos de avaliao Dependentes de cultura

Bactrias so isoladas do ambiente e postas em cultura; cido nuclico extrado da cultura de bactrias para fins de identificao. Desvantagens: No possvel cultivar uma ampla variedade de microorganismos; As bactrias isoladas representam uma pequena parte do que est realmente presente naquele local.

Independentes de cultura
cido nuclico extrado diretamente das amostras coletadas; Geralmente feita a amplificao do DNA a partir do RNA extrado, por PCR; Anlise da diversidade nas amostras amplificadas; Pode haver clonagem e sequenciamento do amplificado para identificar e enumerar as espcies bacterianas presentes na amostra.

A extrao de cidos nuclicos diretamente das amostras do ambiente, chama a ateno para a grande proporo de microorganismos que no so facilmente cultivados em laboratrio, mas que tem grande importncia em atividades de biodegradao.

Genetic Fingerprinting
Tcnicas de impresso digital gentica, como a independente de cultura, demonstram o perfil da diversidade gentica de uma comunidade microbiana. Recentemente vrias destas tcnicas tem sido desenvolvidas e aplicadas em estudos de ecologia microbiana, como biorremediao. A separao ou deteco de pequenas diferenas nas sequencias de DNA especficas podem dar informaes importantes sobre a estrutura da comunidade e a diversidade de microorganismos que contm um gene crtico.

Diversidade microbiana do solo

Fungos e bactrias do solo atuam em diversos ciclos biogeoqumicos, sendo responsveis pela ciclagem de compostos orgnicos; Contribuem para nutrio de plantas; Fornecem estrutura e fertilidade ao solo.

Limitaes do estudo
A maioria dos microorganimos no cultivvel por mtodos laboratoriais; O solo heterogneo uma amostra pode conter mais de uma espcie que de outra ou at mesmo no conter muitas espcies presentes neste solo. H limitaes tambm nos mtodos moleculares lise da clula para extrao, interferncia de outros compostos no resultado, etc; Taxonomia problemas na definio das espcies.

Mtodos de estudo da diversidade microbiana do solo

Tcnicas baseadas em bioqumica
Contagem em placas
Faz-se por plaqueamento seletivo e contagem dos viveis; Limitaes: o Dificuldade em desalojar bactrias e esporos das partculas do solo; o Condies de crescimento (pH, temperatura, luz) o Inabilidade de cultivar diversos microorganismos; o Possibilidade de uma colnia inibir o crescimento de outra; o Crescimento em placas favorece microorganismos com alta taxa de crescimento ou, no caso dos fungos, aqueles que produzem muitos esporos.

 Perfil fisiolgico da comunidade microbiana (uso do carbono) (SSCU)

Como funciona? - Placas possuem 95 espaos, cada um com uma fonte diferente de carbono e uma tinta roxa (inativada), alm de um espao vazio (controle negativo). - Se, e quando, o microorganismo comea a utilizar a fonte de carbono, a tinta roxa reduzida e comea a tingir o espao. - A anlise geralmente feita durante 2 a 5 dias.

Para que usado? - Avaliar o potencial metablico de comunidades de microorganismos em locais contaminados, solos rticos, solos tratados com herbicidas, entre outros. - Estimar diversidade de microorganismos. (riqueza nas respostas) - Estimar similaridade entre comunidades. (padro de desenvolvimento) - Determinar facilidade/dificuldade no uso do carbono. (taxa de mudana da cor em cada espao)

Incubadora - Leitora

Incubadora aberta: capacidade para 50 painis

 Limitaes: o o o o o Usado somente para microorganismos cultivveis em laboratrio; Favorece microorganismos com alta taxa de crescimento; Caracteriza o potencial metablico e no a diversidade; Superestima a contribuio de especies em maior quantidade; As fontes de carbono podem no representar o que h realmente no solo.

Links: Vdeo 1 , Vdeo 2 Nesses vdeos voc acompanha em 8 segundos o que ocorre em aproximadamente 65 horas nos painis de carbono.

 Anlise de cidos graxos (FAME Fatty Acid Methyl Ester analysis)

No depende de cultura; Informa sobre a composio das comunidades microbianas com base nos agrupamentos de cidos graxos; Tem sido usado para avaliar a mudana na composio das comunidades expostas a agentes contaminantes e prticas de agricultura; cidos graxos so extrados diretamente do solo; Metilados; Analisados por cromatografia de gs.

 Limitaes: o A composio celular dos cidos graxos pode ser influenciada por fatores como temperatura e nutrientes; o Outros organismos podem confundir as anlises; o Individualmente, os cidos graxos no podem ser utilizados para diferenciar espcies, visto que diferentes espcies podem possuir o mesmo cido graxo. Ademais, uma mesma espcie pode possuir mais de um cido graxo caracterstico.

 Tcnicas baseadas em estudos moleculares

Contedo de Guanina e Citosina (G+C)

Usado para estudar a diversidade de bactrias em comunidades de solo

Microorganismos possuem diferenas no seu contedo G+C. Grupos relacionados taxonomicamente diferenciam-se em apenas 3% a 5% No h erros por influncia do PCR Pode detectar membros raros de uma populao Uma das maneiras mais comuns de medir atravs de temperatura de derretimento da dupla-hlice de DNA. (espectrofotmetro, 260nm, absorbncia)

Limitaes
Requer grandes quantidades de DNA (at 50 microgramas) Diferentes grupos taxonmicos compartilham a mesma quantidade de G+C

 Reassociao de cidos nuclicos e hibridizao Extraao do DNA de amostras do ambiente; Purificao; Desnaturao; Reanelao.

A quantidade de hibridizao depende da similaridade entre as sequncias presentes; O tempo que metade do DNA leva para se reassociar (the half association value C0t1/2) pode ser usado como um ndice de diversidade. Limitaes: o Pouca sensibilidade se as sequncias no estiverem em grande nmero, no sero detectadas (PCR pode resolver amplificao)

 Abordagens baseadas em PCR

DNA extrado da amostra; Purificado; Primers especficos ou universais; Os produtos resultantes so separados de diferentes maneiras.

Marcaes de rDNA 16S por PCR tem sido usadas para estudar a diversidade de procariotos permite identificao e previso de relacionamentos filogenticos; rDNA 18S e espaadores de transcritos internos (ITS) tem sido utilizados para estudar comunidades fngicas.

 Eletroforese em gel de gradiente desnaturante DGGE / Eletroforese em gel de gradiente de temperatura TGGE DNA extrado das amostras do solo; Amplificado por PCR com primers universais para marcar rRNA 16S ou 18S; o O terminal 5 do primer; Separao Limitaes: o Trabalhosa manipulaao da amostra do contrrio pode influenciar o resultado.

Eletroforese em gel de poliacrilamida

 Polimorfismo de conformao de fita simples SSCP DNA de fita simples separado por eletrofores em gel de poliacrilamida. Esta tcnica tem sido utilizada para medir a sucesso de comunidades bacterianas, comunidades da rizosfera, entre outros. Limitaes: o Trabalhosa manipulao da amostra evitando influenciar o resultado.

Eletroforese em gel de agarose

 Polimorfismo de restrio de comprimento do fragmento RFLP / Anlise de restrio do DNA ribossomal amplificado No PCR rDNA amplificado e digerido por enzimas de restrio dos 4 pares de base; Fragmentos de diferentes tamanhos so formados e detectados utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose. Este mtodo til para detectar mudanas estruturais em comunidades microbianas mas no para medir diversidade ou detectar grupos filogenticos especficos.

 Polimorfismo de fragmento de restrio terminal T-RFLP Segue o mesmo princpio da tcnica de RFLP; Porm um primer marcado com um marcador fluorescente. Limitaes: o Extrao de DNA; o Escolha do primer nenhum primer universal capaz de amplificar todas as sequncias dos 3 domnios; o Pode subestimar a verdadeira diversidade, pois somente as espcies mais numerosas so detectadas; o Digesto incompleta pelas enzimas de restrio pode levar superestimao da diversidade.

 Anlise de espaador intergnico ribossomal RISA / Anlise de espaador intergnico ribissomal automtico ARISA
A regio espaadora intergnica (IGS) entre as subunidades ribossomais 16S e 23S amplificada por PCR; feita a desnaturao; separada por eletroforese em gel de poliacrilamina. Esta regio codifica tRNAs e til para diferenciar cepas bacterianas e espcies muito relacionadas, por causa da heterogeneidade do comprimento e da sequncia da IGS; O mtodo ARISA difere do RISA por utilizar primers marcados com fluorescncia que pode ser detectado automaticamente.

Limitaes:
o As mesmas esperadas em toda a tcnica que envolve PCR dificil manipulao, escolha do primer, etc.

 Caracterizao de sequncias altamente repetitivas / Regies de microsatlites Sequncias de microsatlites podem ser diagnsticas e permitem diferenciao de espcies; Microsatlites amplificados por PCR podem ser comparados usando ndices de similaridade para investigar diferenas inter ou intraespecficas.

Limitaes:
o A sequncia do microsatlite deve ser conhecida para a escolha do primer; o Depende da complexidade da comunidade.

Concluso Vrios mtodos disponveis; Cada um tem suas vantagens e desvantagens; Recomenda-se utilizar mais de um mtodo para resultados mais confiveis e precisos.

Referncias
Kirk, Jennifer L. Beaudette, Lee A. Hart, Miranda. Moutoglis, Peter. Klironomos, John N. Lee, Hung. Trevors, Jack T. Methods of studying soil microbial diversity. 15 jun. 2004. Journal of Microbiological Methods 58 (2004) . p.169 188.

Kapur, Manisha. Jain, Rakesh Kumar. Microbial Diversity: Exploring the Unexplored. India. Institute of Microbial Technology.

Fierer, Noah. Microbial biogeography: patterns in microbial diversity across space and time. In: Accessing Uncultivated Microorganisms: from the Environment to Organisms and Genomes and Back. K. Zengler (editor). ASM Press, Washington DC pgs. 95-115.