Aula 4

Anticorpos monoclonais
Maio de 2003

Os anticorpos que surgem num animal em resposta a um nico antgeno complexo so heterogneos. So formados vrios clones diferentes de clulas B que diferenciam-se em plasmcitos, cada um deles expressando e secretando, respectivamente, um tipo de anticorpo, capaz de reagir com um diferente eptopo no antgeno complexo. Estes anticorpos so denominados policlonais.
linfcitos/plasmcitos

...

anticorpos

antgeno

Os anticorpos que surgem a partir de um nico clone de clulas, como, por exemplo, num tumor de plasmcitos (mieloma) so homogneos, isto , so iguais entre si. So ditos anticorpos monoclonais. Esse histograma mostra uma distribuio tpica de afinidades de anticorpos em um antissoro para um determinante antignico comparando-as com a afinidade nica com que um anticorpo monoclonal se liga ao seu determinante antignico.
Anticorpo monoclonal

Frao de anticorpo total (%) (escala log)

Afinidade de anticorpo (K)

Plasmcitos derivados de um nico linfcito B produzem anticorpos monoclonais, portanto idnticos entre si.

Mtodo de produo de anticorpo monoclonal (tecnologia dos hibridomas) O mtodo envolve fuso celular (ou hibridizao de clulas somticas), entre um linfcito B normal produtor de anticorpo e uma linhagem de mieloma , seguindo-se subsequentemente a seleo de clulas fusionadas que secretem anticorpo da especificidade desejada , derivada do linfcito B normal. Tais linhagens celulares imortalizadas, produtoras de anticorpos e derivados de fuses, so chamadas hibridomas. Os anticorpos que elas produzem so anticorpos monoclonais Antgeno X

Clulas do bao isoladas de camundongo imunizado com antgeno X.

Os monoclonais tm sido produzidos principalmente em camundongos.

Veja a seguir

Mistura de clulas do bao incluindo algumas produtoras de anticorpos anti -X

Linhagem tumoral de mieloma mutante, imortalizada e no cresce em meio seletivo (HAT). incapaz de produzir anticorpos.

Fuso in vitro

Mistura de clulas fusionadas e no fusionadas.

Seleo in vitro em meio de cultivo - HAT

Preparada a diluio no cultivo de modo que em cada poo fique s uma clula me /clone.
Somente clulas fusionadas hbridas (hibridomas) crescem.

Pesquisa de anticorpo anti- X nos sobrenadantes para posterior expanso dos clones positivos

Hibridomas produzindo anti corpo anti- X (Ac monoclonal anti-X).

O sucesso dessa tcnica depende do desenvolvimento das linhagens de mieloma que cresam em meio normal de cultura mas no cresam em um meio seletivo (HAT - hipoxantina, aminopterina e timidina), porque lhes faltam genes funcionais, necessrios para a sntese de DNA pela via de salvao (genes que codificam as enzimas TK e HGPRT). Esses genes esto presentes nas clulas normais, de modo que somente os hbridos e os linfcitos B continuam a crescer no meio seletivo. Aps a fuso, a aminopterina presente no meio bloqueia a sntese de DNA pela via de novo. As clulas podem ento utilizar a via de salvao, j que o meio suplementado com timidina e hipoxantina. Como as linhagens mutantes, no expressam as enzimas necessrias para a referida via de salvao, no vo conseguir sobreviver nesse meio. Como os linfcitos normais possuem vida curta em cultura, somente os clones hbridos sobrevivero e proliferaro secretando anticorpos com a especificidade da clula me que cresceu sozinha e foi selecionada no poo no incio do procedimento.

Veja um resumo dos dois caminhos possveis para a sntese de nucleotdeos pela clula. Se a via de novo estiver bloqueada (como abaixo), s resta a via de salvao:

Via de novo

Via de salvao
Hipoxantina

Fosforribosil pirofosfato + Uridilato

Timidina

hipoxantina guanina fosforribosil timidina cinase (TK) transferase (HGPRT) bloqueio com
aminopterina

Nucleotdeos

A hibridizao de linfcitos o melhor mtodo para produzir um anticorpo monoclonal contra um determinante antignico conhecido. Este anticorpo pode ser usado para identificar antgenos desconhecidos presentes numa mistura, porque cada anticorpo especfico para apenas um determinante antignico . Algumas das aplicaes mais comuns dos anticorpos monoclonais incluem as que se seguem.

1. Identificao de marcadores fenotpicos nicos para os tipos celulares individuais. A base para a classificao moderna de linfcitos e fagcitos mononucleares a ligao de anticorpos monoclonais populao especficos . Estes tm sido usados para definir molculas tpicas de cada clula.
CD64 MFR CD32 CD3 TCR CD2 CD28 CD5 CD7 Tc CD8 LFA-1 Th CD4 Macrfago HLA-D CD35 CD11b CD16

2. Imunodiagnstico: o diagnstico de muitas doenas infecciosas e degenerativas, depende da deteco de antgenos e/ou anticorpos especficos na circulao ou nos tecidos, usando anticorpos monoclonais em imunoensaios.
Exemplo: reao de aglutinao em latex
soro do paciente contendo antgeno com vrios epitopos idnticos

anticorpos monoclonais

partculas de latex adsorvidas com os monoclonais

Para a imunodosagem de hormnios, marcadores tumorais e de outras protenas sricas, sempre se usa anticorpos monoclonais

aglutinao

3.Diagnstico e terapia de tumores: anticorpos monoclonais especficos para tumores so usados para a deteco de tumores por tcnicas de imagens e para a imunoterapia.

4. Anlise funcional de molculas da superfcie celular e secretadas: na pesquisa imunolgica, os anticorpos monoclonais que se ligam a molculas da superfcie celular e estimulam ou inibem funes celulares, so instrumentos inestimveis para definir a funo das molculas de superfcie, incluindo os receptores para antgenos . Anticorpos que neutralizam citocinas so usados para detectar a presena e os papis funcionais destes compostos proteicos in vitro e in vivo .

A Biologia Molecular tem traado o caminho para a produo de anticorpos monoclonais (mAc) de especificidade, afinidade e isotipos definidos. Isto permite aos imunologistas o desenvolvimento de anticorpos de determinada especificidade no camundongo, utilizando-se ento os genes que expressam esta especificidade (genes que codificam VH e VL), para a construo de vetores de clonagem e expresso, associando-os aos genes para os domnios constantes de anticorpos humanos. O mAc resultante (humanizado) de muito baixa imunogenicidade para a nossa espcie, podendo ser utilizado em tratamentos especficos.

FIM