Conjugao e Transduo em bactrias

Prof. Dra. Adriana Dantas UERGS - Bento Gonalves

REPRODUO
Reproduo Assexuada
Diviso celular / Fisso Binria
- Amitose

- Duplicao do DNA

- Separao da clula me em duas cls-filhas

Septo de diviso

REPRODUO
Reproduo Sexuada
Conjugao
Transferncia de plasmdios por pontes citoplasmticas

Transduo
Introduo de fragmentos de DNA entre bactrias Bacterifagos

Transformao
Absoro de fragmentos de DNA de bactrias lisadas no meio

CLASSIFICAO
Corante de Gram
Christian Gram - 1884

Positivas
Negativas

Metodologia
Corante Violeta iodo (fixao) metanol (descolorao) Safranina

Parede Celular + espessa

Gram Positivas
Contraste

Fixam o 1 corante Azul ou Violeta Parede Celular - espessa

Gram Negativas

Descoloradas Vermelho

Fixam o 2 corante

CLASSIFICAO
Bactrias Gram-positivas
Vrias espcies de: Estreptococos; Estafilococos; Enterococos

Bactrias Gram-negativas
Vibrio colrico; Clostridium; salmonelas
goulart@ucg.br

GENTICA BACTERIANA
Genoma relativamente pequeno
Comparado ao Genoma Eucarioto

Contato direto com o citoplasma

Procariotos Ausncia de carioteca

Composto por diferentes modalidades de DNA

- Cromossomo - Plasmdeo - Transposon - Bacterifago

CROMOSSOMO
Fita dupla / Circular

Difuso na regio nucleide

Tamanho varia de acordo com o grupo
< Mycoplasma genitalium (580 Kb) > Myxococcus xanthus (9200 Kb) Parasita x Vida livre

Genes para o metabolismo e ciclo vital Constitudo por partes codificantes

Ausncia de Introns e Regies Intergnicas

Constituem Replicons
Unidades moleculares capazes de replicao autnoma

PLASMDEO
Molcula de DNA circular Tamanho varivel
1.000 x / 10.000 x cromossomo bacteriano

Maioria das bactrias transporta 1 ou + tipos

Genes acessrios
No essenciais sobrevivncia das bactrias Seleo Natural
Resistncia antibiticos, produo de toxinas, ...

Adaptabilidade em condies especiais

Adquiridos pela Conjugao

Reproduo sexuada
Transferncia por pontes citoplasmticas

TRANSPOSON
Fragmentos de DNA linear de tamanho varivel
Mnimo 5 Kb

Codifica protenas acessrias

Enterotoxinas, enzimas degradativas

Elementos mveis
Capazes de inserirem no cromossomo bacteriano

Transposio
Aps a insero deixam cpias no stio e se desligam da molcula

IS Seqncias de insero
Responsvel pelo processo de transposio Seqncias especificas de DNA (~1000 pb ) Codifica Transposase

BACTERIFAGO
DNA de origem viral Insero do DNA viral no cromossomo bacteriano

Vrios bacterifagos transportam genes que codificam fatores de virulncia

Corynebacterium diphtheriae toxina diftrica Clostridium botulinum toxina botulnica Escherichia coli citotoxina

Converso de bactrias no patognicas em patognicas

Aps infeco por bacterifagos

Variabilidade
Embora as mutaes sejam responsveis pela expresso de vrias novas caractersticas por uma clula, muitos dos fentipos expressos pelos microrganismos procariticos so decorrentes da aquisio de novos fragmentos de DNA, por meio de processos de transferncia horizontal de genes.

Processos de Transferncias
Transformao Conjugao Transduo. Converso lisognica

Transformao
definida como um processo de incorporao de DNA na forma livre, geralmente decorrente da lise celular. A partir de seu descobrimento, foi demonstrado formalmente que o DNA era a molcula envolvida na hereditariedade (F. Griffith, 1928). Vrias bactrias Gram positivas e negativas so naturalmente transformveis, entretanto, dentro de um gnero, nem todas as espcies o so.

Reproduo Bacteriana Transformao

Reproduo sexuada A transferncia de material gentico ocorre quando uma clula receptora capta DNA solvel liberado no meio por clulas doadoras.

Transformao natural
Processo de incorporao de DNA exgeno na forma livre, geralmente decorrente da lise celular ou extrados de clulas doadoras. Para que ocorra transformao a clula deve ser competente, isto , deve apresentar stios de superfcie para a ligao do DNA da clula doadora e apresentar a membrana em uma condio que permita a passagem deste DNA. Envolve a participao de diferentes protenas (protena de ligao ao DNA, presente na membrana, autolisinas, nucleases), sendo um processo varivel entre os microrganismos (nem todos apresentam competncia). Exemplos de bactrias naturalmente competentes: Bacillus, Streptococcus, Neisseria

Clula transformada (recombinante)

Processo de Transformaao
Na natureza, o processo ocorre quando uma clula sofre lise, liberando seu DNA. Este, por ser de grande tamanho tende a sofrer quebras, originando centenas fragmentos de aproximadamente 15 kb (o equivalente a cerca de 15 genes, em Bacillus subtilis). Como uma clula absorve poucos fragmentos, apenas uma pequena proporo de genes podem ser transferidos. Inicialmente, para que o processo ocorra, necessrio que a cl. encontre-se competente, isto , deve apresentar stios de superfcie para a ligao do DNA da clula doadora e apresentar a membrana em uma condio que permita a passagem deste DNA.

Competncia celular
Aparentemente, o nmero de stios disponveis para a ligao do DNA limitado. Esta captao parece estar relacionada a uma pequena sequncia, de 10 a 12 pares de bases, presente no DNA exgeno. Em Haemophilus, foi demostrada a presena de uma protena que reconhece e liga-se a uma sequncia 5 AAGTGGGTCA - 3, muito comum no genoma deste microrganismo, garantindo que somente ocorrer a captao de DNA de espcies muito similares.

A competncia um processo que depende de vrias condies distintas nos diferentes microrganismos. Sabese que a fase de crescimento e as condies ambientais desempenham um papel de extrema importncia no processo. Alm destes, a temperatura e a concentrao de ctions tambm influenciam a eficincia do processo.

Captaao do DNA
A captao do DNA tambm diferente entre Gram positivos (G+) e Gram negativos (G-): Nas G+ o DNA captado como dupla hlice e absorvido como fita simples, sendo uma das fitas degradadas. Nas G-, o DNA absorvido como fita dupla, embora apenas uma das fitas participe do processo de recombinao. Independente do tipo celular, a ligao do DNA clula mais eficiente quando est como fita dupla.

Ligao do DNA
As clulas competentes ligam o DNA com muito mais eficincia que clulas no competentes (1000 vezes mais). Streptococcus pneumoniae capaz de ligar apenas cerca de 10 molculas de DNA de dupla fita, de 15 a 20 kb.
Quando so absorvidas, como DNA de fita simples, estas passam para cerca de 8 kb.

Em Haemophilus influenzae, necessrio que o DNA tenha uma sequncia especfica de 11 pb, para que haja a ligao irreversvel e o DNA seja captado.

Integrao do DNA:
O DNA liga-se a protenas na superfcie celular, sendo em seguida absorvido ou tendo uma de suas fitas degradadas por nucleases antes da absoro. medida que o DNA absorvido no interior da clula, este se associa a protenas de ligao ao DNA de fita simples, protegendo-o de degradao. A protena RecA tambm participa deste processo, associando-se fita e promovendo a recombinao. H ento a degradao do que resta da fita simples e formao de um DNA hbrido, que na replicao originar uma molcula parental e outra recombinante.

Transformao em Streptococcus, um organismo Gram positivo.

O autoindutor (1) ao encontrar o receptor (2) interage com este, promovendo a ativao de vrios genes (3, 4 e 5) dentre eles as autolisinas, nucleases e protena de ligao ao DNA. Uma das fitas do DNA passa a ser captada pela clula, enquanto a outra degradada (6).

Ao penetrar na clula a fita simples protegida por protenas. Caso este DNa encontre uma regio complementar, a protena RecA auxiliar sua recombinao com o DNA endgeno (7).

Conjugao
Processo de transferncia de DNA de uma bactria para outra, envolvendo o contato entre as duas clulas (Tatum & Lederberg, 1946). A conjugao est associada presena de plasmdeos de natureza F. Estes plasmdeos contm genes que permitem a transferncia do DNA plasmidial de uma clula para outra ou, em outras palavras, a capacidade conjugativa. Quando a clula porta um plasmdeo de natureza F denominada F+, doadora, ou macho, enquanto clulas desprovidas de tais plasmdeos so denominadas F-, receptoras, ou fmeas.

Reproduo Bacteriana Conjugao

Reproduo sexuada um processo de transferncia de material gentico, promovido por plasmdios conjugativos.

Conjugao
Transferncia de genes atravs do contato entre clulas bacterianas. O DNA transferido diretamente de uma bactria para outra. 2 tipos de clulas envolvidas na conjugao: Doadora: possui plasmidio F (fertilidade) denominada clula F+ Receptora: no possui plasmdio F, denominada clula F-

Clulas Hfr (high frequency of recombination) so clulas onde o plasmdio F torna-se integrado ao cromossoma. Possuem maior capacidade conjugativa ou de transferncia.

Transferncia do plasmdio F de uma clula doadora (F+) para clula receptora (F-)

O cruzamento entre clula Hfr x F- resulta na transferncia de fragmentos de DNA cromossomal de uma clula para outra. Raramente ocorre transferncia completa dos genes do plasmdio F ento a clula receptora continua F- porm incorpora genes da clula doadora em seu genoma (recombinao)

 A capacidade conjugativa est associada presena de determinados genes localizados em um operon denominado tra. Estes genes conferem uma srie de caractersticas envolvidas na conjugao tais como a sntese do pilus F, responsvel pelo reconhecimento e contato entre as clulas, assim como a transferncia do DNA plasmidial.
Eventualmente, os plasmdeos podem ser integrados no cromossomo, sendo este processo mediado por pequenas seqncias de DNA denominadas IS (insertion sequences). As clulas apresentados tais plasmdeos integrados so denominadas Hfr (do ingls High Frequency of Recombination). Quando integrados, esses plasmdeos podem mobilizar a transferncia de genes cromossomais tambm.

Conjugaao em gram negativas

Dois tipos: entre clulas F+ e F-, resultando em duas clulas F+ entre clulas Hfr e F-, resultando em uma clula Hfr e outra F-. Nos dois processos, acredita-se que o mecanismo provvel de transferncia do DNA seja pelo crculo rolante, onde apenas uma das fitas transferida, sendo a fita complementar sintetizada pela clula receptora. O estmulo para o disparo do processo seja o contato das clulas. Assim, a conjugao envolve a passagem de DNA de uma clula F+ para outra F-, que torna-se ento F+ tambm. Nestes casos, passam grandes blocos de DNA da clula Hfr para a receptora, promovendo extensas recombinaes.

Transduo bacteriana
Transferncia de informao gentica mediada por um bacterifago

Transferncia mediada por vrus, podendo ser generalizada (qualquer fragmento de DNA) ou especializada (determinados genes, passados por fagos temperados).

Reproduo Bacteriana Transduo

Reproduo sexuada a transferncia dos genes cromossmicos ou de molculas de plasmdios de uma bactria para outra, por meio de um bacterfago.

Bacterifago
Um fago (tambm chamado bacterifago) um pequeno vrus que infecta apenas bactrias. Da mesma forma que vrus que infectam eucariontes, os fagos consistem numa protena exterior protetora e no material gentico (dupla hlice em 95% dos fagos conhecidos) dentro da cpsula de 5-650 Kbp (1 Kpb = 1.000 pares de bases). Os fagos foram descobertos independentemente por Frederick Twort em 1915 e por Flix DHerelle em 1917.

Fagos
Fagos infectam especificamente bactrias.

Alguns fagos so virulentos, significando que uma vez que a clula tenha sido invadida, eles imediatamente iniciam seu processo de reproduo, e em pouco tempo "lisam" (destroem) a clula, lanando novos fagos. Alguns fagos (bem conhecidos como fagos temperados) podem ao contrrio entrar em um estado relativamente inofensivo, e ento integrar seu material gentico no DNA cromossomal da bactria hospedeira (muito semelhantes aos retrovrus endgenos em animais) ou estabelecendose a si mesmos como plasmdeos.

 Estes fagos endgenos, referidos como profagos, so ento copiados a cada diviso celular junto com o DNA da bactria hospedeira. Eles no matam a clula, porm monitoram (via algumas protenas que eles codificam para isto) o estado de seu hospedeiro. Quando a clula do hospedeiro mostra sinais de stress (significando que ela esteja prxima de sua morte), os fagos endgenos tornam-se ativos novamente e iniciam seu ciclo reprodutivo, resultando na lise de clula hospedeira. Um exemplo o fago lambda da E. coli. Algumas vezes, mesmo profagos podem prover benefcios para as clulas hospedeiras enquando dormentes, pela adio de novas funes ao genoma da bactria, um fenmeno chamado converso lisognica.

Importncia na biologia molecular

Utilizados como vetores de clonagem para inserir DNA bas bactrias. Eles esto sendo tambm avaliados por pesquisadores mdicos como uma alternativa aos antibiticos para tratar infeces por bactrias (porque matar bactrias o que os fagos fazem de melhor). Phage display um teste para investivar interaes de protenas pela integrao de mltiplos genes de um banco de genes em fagos.

Transduo generalizada
Descoberta em Salmonella typhimurium com o fago P22, embora este processo tambm ocorra em outras bactrias, tais como E. coli. Este tipo de processo requer a ocorrncia de um ciclo ltico, onde eventualmente pode haver o empacotamento de fragmentos de DNA da clula hospedeira, gerando partculas denominadas partculas transdutoras, que correspondem ao capsdeo viral contendo em seu interior DNA bacteriano. Embora no possam ser descritas como vrus, as partculas transdutoras exibem a capacidade de adsoro superfcie de outras clulas bacterianas. A frequncia com que um determinado gene transferido baixa uma vez que cada partcula transdutora leva apenas um determinado fragmento de DNA (1 em 106 ou 108 cl. recebem um determinado gene).

Transduo generalizada: durante um ciclo ltico, pode haver a incorporao de DNA bacteriano no capsdeo viral. Este DNA poder ser transferido para outra bactria, pois os processos de adsoro e injeo de DNA dependem da estrutura do vrus, independente do tipo de DNA contido em seu interior .

Transduo especializada:
Evento raro, embora bastante eficiente.
O exemplo melhor conhecido e primeiramente descoberto foi a transferncia de um genes que codificam produtos envolvidos na degradao de galactose pelo fago l de E. coli. A etapa inicial no processo corresponde infeco e lisogenizao do fago, que ocorre em stios especficos do genoma. Neste caso, a integrao do fago ocorre adjacente ao conjunto de genes envolvidos na utilizao de galactose.

Transduo especializada
Pela ao de algum indutor (ex: UV) h a separao do fago do genoma (integrao reversa), que normalmente ocorre perfeitamente. Entretanto, em alguns casos, essa separao defeituosa, promovendo a remoo de genes bacterianos e deixando parte do genoma viral na clula. Essas partculas podem ser de dois tipos:
aquelas que carregam genes gal outras que carregam genes bio.

Aquelas partculas levando genes gal so denominadas ldgal (defectivas, contendo o gene gal), porque so incapazes de formar partculas virais maduras (porque deixam no hospedeiro o gene que codifica a protena integrase).

Transduo especializada: este processo dependente da ocorrncia de um ciclo lisognico. O fago integra seu DNA ao DNA bacteriano e aps um determinado perodo de tempo e de acordo com certos estmulos, este fago pode iniciar um ciclo ltico. Caso a exciso do DNA viral ocorra de maneira defeituosa, poder haver a transferncia de um pequeno fragmento de DNA bacteriano (porque parte do DNA viral ficar incorporado ao genoma bacteriano). Este vrus "defeituoso" poder transferir o DNA bacteriano para outras clulas.

Converso lisognica:
Transferncia de genes de fagos para bactrias. A prpria lisogenizao torna a bactria imune a outras infeces por este fago, mas alm disso, outros fentipos podem ser adquiridos. O exemplo mais clssico consiste na converso de clulas atoxignicas de Corynebacterium diphtheriae em toxignicas, pelo fago . Assim, a bactria recebe um gene que codifica uma toxina, sendo este gene de origem viral.

Biologia do Bacteriofago
Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular o denominado bacterifago , o qual comporta-se como um vrus da E.coli. O fago um parasita obrigatrio da E.coli, o qual necessariamente deve injetar o seu DNA na bactria hospedeira para a sua multiplicao.

Infeco da E .coli o genoma do fago pode seguir duas vias:

a) Estado ltico, o DNA do fago permanece na bactria como uma molcula independente, havendo a ativao de alguns genes do fago e a concomitante inativao de outros, dentro de um programa estritamente definido.
Como resultado o cromossomo do fago replicado ativamente, ocorre a sntese das protenas da capa e da cauda, formam-se novas partculas virais. Em aproximadamente 45 minutos aps a infeco a clula hospedeira lisada havendo a liberao de cerca de 100 novos fagos.

Infeco da E .coli o genoma do fago pode seguir duas vias:

b) Estado lisognico: Neste caso, o DNA do fago integrado no cromossomo da bactria passando a ser chamado profago.

No estado lisognico, todos os genes do profago esto inativos com excesso do gene que produz a protena repressora.
A bactria hospedeira carregando o profago multiplica-se e este replicado passivamente e distribudo para as bactrias descendentes.

 Em condies naturais a opo entre seguir o estado ltico ou lisognico depende das condies do meio. Assim, via de regra em meio rico em nutrientes o estado ltico preferencial, por exemplo o fago na bactria E.coli intestinal.
Por outro lado, em meio pobre de nutrientes como o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisognico. Em condies experimentais, o estado a ser seguido depende de um balano entre os fatores do meio intra e extra celular e de fatores genticos da bactria hospedeira e do bacterifago

Genoma do fago
O bacterifago l uma partcula viral constituda de aproximadamente 50% de protenas e 50% de DNA. O DNA do fago , na forma como ele isolado da partcula viral, uma molcula linear com dupla fita de aproximadamente 48.500 pares de bases. As extremidades da molcula contm uma frao de DNA fita simples com cerca de 12 nucleotdeos, os quais so complementares na sequncia de bases e atravs delas que o DNA assume a forma circular quando ele injetado na clula hospedeira. Estas extremidades so denominadas de stio cos.

O genoma do fago codifica para aproximadamente 50 protenas, cujos genes tem um cronograma de expresso bem definido, o que determina a instalao do estado ltico ou lisognico.