Digestin de DNA usando Enzimas de Restriccin

Biol 3051L

Objetivos
El cortar el DNA con enzimas de restriccin es muchas veces el primer paso de los investigadores para estudiar un gen. En este laboratorio se har lo siguiente: Exponer al estudiante a tecnologa actual. Usar enzimas de restriccin para cortar el DNA. Separar los fragmentos usando electroforsis. Analizarn un gel con DNA cortado con diferentes enzimas de restriccin.

Restriccin de DNA

En bacterias, un plsmido, una pieza circular de DNA, constituye una gran parte del material gentico. El plsmido tiene que hacerse linear para poder recombinarse. Las enzimas de restriccin reconocen secuencias especficas en el DNA.

Lambda DNA:

Un vector ampliamente usado para crear DNA recombinante. 48,502 pares de bases de longitud. Usualmente un DNA recombinante de lambda tiene 80% DNA del vector y 20% del DNA insertado.

Enzimas de restriccin

Tambin conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester a partir de ua secuencia que reconocen. La secuencia que reconocen es una secuencia palindrmica (secuencia que se lee igual en ambas direcciones). Son extradas de bacterias, donde actuan como mecanismo de defensa para degradar material gentico extrao que entre en la clula. Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII y EcoRI, toman el nombre de las bacterias que la producen:

EcoRI: E = gnero Escherichia. co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Las enzimas de restriccin al cortar DNA pueden producir dos tipos de cortes:

Cohesivos o pegajosos: cortan a manera escalonada en dos puntos diferentes.

Abruptos: cortan en un slo punto.

Corte cohesivo con EcoRI:

Electroforesis de DNA:

Despus de tratar el lambda DNA con las diferentes enzimas, los fragmentos son separados por su tamao usando un gel de electroforesis. Luego de que la gel se corre el DNA se tie para revelar los patrones de bandas formados en el gel que corresponden a fragmentos de diferentes tamaos.

Principios de electroforesis

Tcnica usada para separar y purificar macromolculas (i.e. proteinas, cidos nucleicos) que varan en tamao, carga o conformacin. Cuando molculas cargadas son colocadas en un campo elctrico, estas migran hacia el polo positivo (nodo) o polo negativo (ctodo) de acuerdo a su carga.

Geles comnmente usados:

Agarosa: polisacrido extraido de algas. No txico. Poco poder de resolucin pero alto grado de separacin. Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb.

Poliacrilamida: polmero de acrilamida. Txico. Menor grado de separacin pero alto poder de resolucin. Usado para fragmentos de DNA de 500 pb. Usado para separar mezclas de protenas.

Preparacin de gel:

La mezcla de agarosa y buffer tiene que ponerse a calentar, agitando frecuentemente hasta que llegue al punto donde comience a hervir.

Una vez que el frasco con la agarosa ya pueda tocarse sin quemarse, vertir con cuidado la mezcla en la bandeja. Dejar que se torne opaco y slido.

Prctica de uso de micropipetas:

Apoye brazo que est agarrando micropipeta en superficie firme. Utilice la mano contraria para apoyar la micropipeta Introduzca punta de micropipeta dentro de fosa, sin tocar el gel Vierta el contenido en fosa, presionando botn de la pipeta hasta primer punto de resistencia

Cuando la gel solidifique y se torne opaca, sacar la peinilla y poner gel en cmara de electroforsis con fosas del lado del polo negativo. Proceder a pipetear las muestras en las fosas. Correr gel. Teir.

Resultados luego de teir:

A: marcador con pedazos de tamao conocidos. B: Lamda cortado con Eco R1. C: Lamda sin cortar.