CONCEPTOS BASICOS Y FUNDAMENTALES EN SEROLOGIA ERITROCITARIA

Dra. Gina Laitano MBA Escuela de Microbiologa UNAH

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Elementos Principales que Participan: - Antgeno (Ag) - Anticuerpo (Ac) - Respuesta Inmune - Reaccin Ag Ac - Complemento

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Aplicaciones: 1. Estudio de los grupos sanguneos: Ag presentes en: - Hemates (ABO, Rh.) - Plaquetas - Granulocitos - Linfocitos (HLA)

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Aplicaciones: 2. Estudio de anticuerpos: Aquellos Acs contra antgenos presentes en las clulas sanguneas: - Anemias hemolticas - Pruebas pretransfusionales - Prevencin de la enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN) - Estudios de las trombocitopenias

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Antgeno: Sustancia que al introducirse en el organismo es capz de producir una respuesta inmune especfica, con formacin de anticuerpos. La parte del antgeno que reacciona con el anticuerpo se llama determinante antignico. El determinante antignico puede formarse por varios eptopos los cuales se complementan con el lugar de combinacin del Ac.

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Anticuerpo: - Son protenas plasmticas que se forman en el organismo como respuesta a la entrada de un antgeno. - Se sitan en la fraccin gama, y por su relacin con la inmunidad se les llama inmunoglobulinas (Ig)

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Los anticuerpos de los hemates se dividen: 1. Segn su origen 2. Segn su accin 3. Segn el antgeno al que vayan dirigidos

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Anticuerpos de los hemates: 1. Segn su origen: a. Naturales: Aparecen sin tener una estimulacin detectable. Pueden ser IgM o mezcla de IgM + IgG: . Regulares (ABO): Aparecen siempre que no posee el antgeno correspondiente . Irregulares: No siempre aparecen cuando no posee el antgeno.

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Anticuerpos de los hemates: 1. Segn su origen: b. Inmunes: Se producen despus de una estimulacin antignica (transfusin, embarazo). Son casi siempre IgG.

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

2. Segn su accin: a. Aglutinantes: Se les llama tambin completos. Casi siempre son IgM. b. No aglutinantes, inmunes o incompletos: Requieren otras tcnicas (enzimas, medios macromolculares como la albumina, AGH) para observar la aglutinacin.

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

3. Dependiendo del antgeno al que vayan dirigidos: - Autoanticuerpo: Dirigido contra un antgeno propio. - Aloanticuerpo: Dirigido contra un antgeno extrao

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Reaccin in vitro Ag-Ac: - Fenotipo: Hemates + Ac con especificidad conocida - Investigacin de Acs: Suero + hemates de composicin antgenica conocida - Se puede observar: . Aglutinacin . Hemlisis

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Reaccin in vitro Ag-Ac: - Primero se produce la sensibilizacin de los hemates (el Ac se fija a los Ags de la membrana del hemate) y posteriormente su aglutinacin. - Hay factores fsicos y qumicos que afectan este proceso.

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Factores que Afectan a la Fase de Sensibilizacin: - Temperatura . Hay un grado trmico ptimo para cada Ac aplicable a los grupos sanguneos. . Hay Acs que se fijan mejor a los hemates a: - 37 C - Temperatura ambiente - 4 C

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Temperatura: . Acs fros ( I, M, N, P) . Acs calientes ( Rh, Jk, K.) - pH La sensibilizacin de la mayora de los hemates necesita un pH entre 6.9 y 7.2
-

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Tiempo de incubacin El estado de equilibrio sin potenciadores es de 15 a 60 segn el Ac. - Tipo y naturaleza del Ac . Acs Aglutinantes casi siempre son IgM y la aglutinacin aparece en solucin salina. . Acs no aglutinantes necesitan sustancias para potenciar la aglutinacin (macromolculas, enzimas, AGH)

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

-

Proporcin entre Ag y Ac: Debe haber una relacin entre el nmero de molculas del Ac y los Ag de los hemates. El exceso de antgenos reduce el nmero de Acs unidos por GR. Se prefiere contar con Acs en exceso. Es comn usar 2 gotas de suero por cada gota de GR 2-5%.

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Si los Acs son debilmente reactivos, al aumentar su
concentracin aumenta la sensibilidad de la prueba. Al utilizar LISS se debe de cumplir con las instrucciones del fabricante sobre la proporcion de suero y LISS.

Constante de afinidad del Ac A mayor afinidad del Ac ms rpida la velocidad asociacin y ms lenta la de disociacin

ZONA

A N T

PROZONA

EQUIVALENCIA

POSTZONA

I
C U E R P O

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

Factores que Afectan la Fase de Aglutinacin: - Intensidad inica del medio (potencial Z): . Los hemates tienen carga negativa y por eso se repelen. . El potencial Z es la diferencia de potencial entre el hemate cargado negativamente y rodeado de una nube de cargas (+) y el medio

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

. El potencial Z es el responsable de la fuerza de repulsin de los hemates. . Solo hay aglutinacin si los hemates estn lo suficientemente prximos entre s. . Los Acs IgM siempre pueden producir aglutinacin. . Los Acs IgG producen aglutinacin dependiendo de la localizacin del eptopo del Ag.

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

-

Tipo de Anticuerpo . Los Acs IgM siempre pueden producir aglutinacin. . Los Acs IgG producen aglutinacin dependiendo de donde est localizado el eptopo del Ag

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Conceptos Bsicos en Serologa Eritrocitaria

2. Solucin de Fuerza Inica Baja (LISS): . Aumenta la sensibilizacin por disminucin de la nube inica alrededor de los hemates. . Acorta el tiempo de sensibilizacin pues el Ac llega ms fcil al hemate. . Hay falsos sino se respeta la proporcin LISS-suero y el tiempo de incubacin.

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Potenciadores de la Reaccin Ag-Ac

Significado clnico de anticuerpos de grupo sanguneo C A R A C T E R I S T I C A S

Especificidad

Anticuerpo

Rango trmico
Clase, subclase, afinidad, activacin del C Concentracin en plasma

Disociacin del hemate

Antgeno
Nmero de sitios antignicos

Sistema inmune del paciente

51

Mtodos para Observar Aglutinacin

1. Tcnica en tubo: . Es la tcnica estndar . Se pueden aadir aditivos para potenciar la reaccin: Liss, enzimas, macromolculas, AGH . Es visible la hemlisis

Mtodos para Observar Aglutinacin

. La aglutinacin es inestable . Requiere lectura cuidadosa . Utiliza una cantidad importante de hemates y suero

Mtodos para Observar Aglutinacin

2. Aglutinacin en columna: . Son soportes con unas columnas que contienen gel. . La reaccin es semipermanente y necesita pequeas cantidades de reactivo.

Mtodos para Observar Aglutinacin

3. Tcnicas en microplaca: . Utiliza unas microplacas de plstico que contiene 96 pocillos. . Se usan para procesar grandes series de muestras.

Prueba de Coombs

Prueba de Antiglobulina o de Coombs: - Se describi en 1,945 por Coombs, Mourant y Race para detectar los Acs no aglutinantes o incompletos. - Despus se us para demostrar la sensibilizacin de los hemates in vivo en pacientes con AHA (anemia hemoltica autoinmune)

Prueba de Coombs

Principio de la Prueba de Coombs: La aglutinacin de los hemates cuando estn sensibilizados con Acs IgG o complemento se puede visualizar al adicionar suero antiglobulina o de Coombs.

Prueba de Coombs

Prueba de Coombs

Obtencin del suero de Coombs: Se obtiene al inmunizar animales con globulinas humanas y luego su suero reaccionar especficamente con las globulinas humanas.

Prueba de Coombs

Prueba de Coombs
1. Prueba de Coombs Directo: . Es til para investigar eritrocitos sensibilizados in vivo. . Consiste en aadir antiglobulina humana a los hemates en estudio. Si estn recubiertos con IgG o C la prueba ser positiva.

Prueba de Coombs
1. Prueba de Coombs Directo: Se realiza para investigar Acs antieritrocitos fijados en los hemates: . Diagnstico de la anemia hemoltica autoinmune (AHA). . Enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN). . Hemlisis por frmacos . Reaccin hemoltica postransfusional

Prueba de Coombs
2. Prueba de Coombs Indirecto o antiglobulina Indirecta: . Se realiza en el suero sensibilizando in vitro hemates de fenotipo conocido. . Investiga Acs irregulares antieritrocitarios en el suero de una persona.

Prueba de Coombs
2. Prueba de Coombs Indirecto o antiglobulina Indirecta: Est indicada en: . Deteccin e identificacin de Acs antieritrocitarios: - Pruebas de compatibilidad - Control de mujeres embarazadas - Donantes . Tipificacin de Ags eritrocitarios que no se visualizan por aglutinacin directa: Ag D dbil en los Rh negativos (Du)

Anticuerpos Irregulares

Adquiridos: Conocidos como inmunes, producidos por la exposicin a Ags desconocidos por el individuo al momento de la transfusin o en mujeres por el embarazo (contra Ags diferentes al ABO). Aloanticuerpos Irregulares (adquiridos): Mas comunes MNSs, P1, Kidd (Jka, Jkb), Duffy (Fya, Fyb), Kell, Lewis y Diego.

Prueba de Coombs
2. Prueba de Coombs Indirecto o antiglobulina Indirecta: La tcnica tiene 2 fases: - Sensibilizacin de hemates reactivo (GR de donantes o con fenotipo conocido) incubndolos con el suero del individuo a estudiar. - Aadir antiglobulina para observar la aglutinacin.

Coombs indirecto

Eritrocitos no sensibilizados

Suero fresco

Mezclar e incubar

Clulas sensibilizadas In vivo

Sensibilizacin in vitro

Lavar para remover excedente de IgG & C Adicionar suero de Coombs

Aglutinacin

DETECCION DE ACS IRREGULARES

1 gota de eritrocitos 2-4%

2 gotas
Mezclar y 1 2 3
AT

30 seg 3400 rpm y leer

Incubar 37C de 30-60 min

Mezclar y
1 gota de eritrocitos de cada frasco de clulas en cada tubo correspondiente

30 seg 3400 rpm y leer

Lavar 3 veces. SS

Mezclar y 30 seg 3400 rpm y leer

Adicionar 2 gotas de Suero de Coombs

Mezclar y 30 seg 3400 rpm y leer

Agregar 1 gota
de CCC

DETECCIN DE AC IRREGULARES

D C E c e M N S s P1 1 2 3 + + _ _ _ + + _ _ + + +

Lea + _ _

Leb K _ + _ + _ _

k Fya + + + + _ +

Fyb _ + +

Jka + _ +

Jkb _ + +

Dia _ _ +

+ _ + + + _ _ + _ _ _ + + +

_ _ _ _

Elegir GR panel que cubran los antgenos Deteccin de Anticuerpos clnicamente significativos. Expresin homocigota aumenta la sensibilidad:

Ac dbiles pueden no detectarse si los GR no son homocigotos para el Ag especfico

Falso negativo: Lectura con excesiva agitacin Lavado a bajo pH Para validar los resultados negativos usar Clulas Control Coombs: GR O positivos sensibilizados con anti D

Prueba de Coombs