TECNICAS DE ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS

HIBRIDACION
DE ACIDOS NUCLEICOS
DOCENTE: Mara Soledad Depix UST

Desnaturalizacin y Renaturalizacin por efecto de la Temperatura

DESNATURALIZACIN DEL DNA

1. Fuerza inica
50%

2. Longitud DNA doble 3. Composicin de bases

Tm oC = 2 x no(A + T) + 4 x n(G + C)

Curva de Desnaturalizacin y Composicin de Bases

CAMBIOS EN LA VISCOSIDAD Y ABSORBANCIA A 260 nm

 Qu

es la Tm?

Tm = temperatura de melting o de separacin de las hebras. La Tm es una medida de la estabilidad de los hbridos definida como la temperatura a la cual 50% de los hbridos se encuentran formados y 50% permanecen disociados.

50% 5 - - - - - - - - - - -3 3 - - - - - - - - - - 5

50%

HIBRIDACION

2 elementos bsicos: Secuencia diana y sonda

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

Nmero de pares GC v/s pares AT Grado de complementariedad Largo de las hebras Concentracin de sal en la solucin Temperatura Concentracin de formamida

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

Nmero de pares GC v/s pares AT

Mayor nmero de enlaces de H entre la hebras mayor estabilidad

de los hbridos. 3 enlaces de H entre G y C 2 enlaces de H entre A y T

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

Temperatura

Mayor T aumenta la energa cintica de las hebras

y desestabiliza la estructura de los cidos nucleicos. las hebras se separan.

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

Grado de complementariedad

Menor complementariedad de bases, menos enlaces de H formados

menor estabilidad

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

Largo de las hebras

Mayor largo de las hebras (cDNAs) >200pb

ms enlaces de H mayor estabilidad del hbrido.

Menor largo de las hebras (oligos) <50pb

Mayor especificidad Menor probabilidad de hibridacin cruzada

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

Concentracin de sal en la solucin

[sal] estabilidad del hbrido

Cationes monovalentes (Na+) o

divalentes (Mg++) Las cargas negativas de los grupos fosfato se repelen unas a otras. Los iones positivos en solucin reducen la repulsin electrosttica entre las hebras.

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

pH

[OH- ] ionizacin de los grupos fosfatos favoreciendo la repulsin

electrosttica entre las hebras.

Concentracin de formamida

Probablemente forma enlaces de H con los cidos nucleicos. Desestabiliza la formacin de hbridos

Exigencia o rigor de la tcnica de hibridacin

El RIGOR da el grado de especificidad en el apareamiento conseguido en los hbridos

Los ensayos de hibridacin se pueden clasificar en tres grupos:

Hibridacin en fase lquida

Hibridacin en soporte slido: -Dot-blot y slot blot -Southern-blot -Northern blot

Hibridacin in situ -Tisular -Cromosmica (FISH)

HIBRIDACION EN SOPORTE SOLIDO

Deteccin de colonias recombinantes

HIBRIDACION DOT y SLOT BLOT

SOUTHERN BLOT

Figure 8-38 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Figure 8-38 (part 1 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Figure 8-38 (part 2 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Figure 8-38 (part 3 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Figure 8-38 (part 4 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

FISH

IDENTIFICACION DE ZONAS ESPECIFICAS EN CROMOSOMAS

Sistemas de Marcaje de Sondas

Grupos Indicadores