Determinacin de Salmonella spp.

En alimentos
Facultad de Qumica, UNAM Microbiologa de Alimentos Laboratorio, 03 Equipo 10:
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Objetivos
A.

B.

Aplicar adecuadamente la tcnica descrita en la NOM para la deteccin del gnero Salmonella. Explicar el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin de Salmonella en alimentos.

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Generalidades
Salmonella ssp.: Bacilo Gram-negativo Anaerobio facultativo familia Enterobacteriaceae Mvil Lactosa (-) Metabolismo de va fermentativa y aerobio Produccin de cido y gas Oxidasa (-) 5/19/12 Catalasa (-)

Definicin contempornea

Salmonella tpica: Produce cido y gas a partir de la glucosa en el agar TSI No es capaz de utilizar lactosa y Clasificacin sacarosa en este medio o en medios slidos selectivos. a) Los que no tienen preferencia por algn husped en especial. b) Los que infectan slo al hombre. c) Los que estn adaptados a un husped animal. 5/19/12

Excepciones

Por variabilidad gentica: Mutaciones Intercambio intra e intergenrico de plsmidos

Se han encontrado biotipos: 5/19/12 lactosa (+) y/o sacarosa (+)

Distribucin de Salmonella spp.

Inherente a prcticas agrcolas en Industria crnica, Industria pesquera, Industria lctea. El sector avcola es la principal fuente de Salmonella spp.

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Infeccin

Alto riesgo de invasin intestinal en: Recin nacidos 3a Edad Dsis infectiva en humanos: 1 a 10 clulas. Alimentos con alto contenido de grasa: Las clulas de Salmonella se engloban en micelas lipdicas y sobreviven al cido gstrico.
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Fiebre entrica

Incubacin: 7 a 28 das. Sintomatologa: Diarrea, Fiebre, Dolor abdominal, Dolor de cabeza, Debilitamiento. Diagnstico: Etapas tempranas en sangre o en heces. Tratamiento: Uso de croramfenicol, ampicilina, trimetropim.
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Enterocolitis

Incubacin: 8 a 72 horas. Sintomatologa: Heces tpicas diarreicas no sanguinolientas, Dolor abdominal. Tratamiento: Reempalzo de fluidos y electrolitos. NO ANTIBITICOS.

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Protocolo de aislamiento
Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994 Bacteriology Analytical Manual - FDA
1.

Pre-enriquecimiento. Enriquecimiento selectivo.

1.

1.

Aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales, identificacin bioqumica y confirmacin serolgica. 5/19/12

Metodologa clsica para la determinacin de Salmonella spp. en alimentos

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25 g de muestra en condiciones de asepsia

Homogeneizar: 225 mL de solucin diluyente (caldo lactosado) segn el tipo de muestra

Incubar 18-24h a 37C

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales*

XLD, SS, Hecktoen, VB, Sulfito bismuto Haga clic para modificar el estilo de subttulo del patrn

Incub ar 1824h a 37C

Siembra con asa bacteriolgica en caldo Tetrationato y C. Selenito Cistina

Caractersticas Color antes de la Medio selectivo coloniales de inoculacin Salmonella spp.

Agar verde brillante Oscuro color Marrn Rosas o rojas, pueden ser transparentes rodeadas de medio enrojecido. Las bacterias fermentadoras de lactosa pueden ser amarillas

Caractersticas Color antes de la Medio selectivo coloniales de inoculacin Salmonella spp. Agar sulfito bismuto Opaco, verde plido Caf, grises o negras; con o sin brillo metlico. Algunas veces presencia de halo caf o negro

Medio selectivo Color antes de la Caractersticas inoculacin coloniales de Salmonella spp. Agar Xilosa Lisina Desoxicolato Claro, rojo brillante Rosas o rojas pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras

Caractersticas Color antes de la Medio selectivo coloniales de inoculacin Salmonella spp. Agar para Salmonella y Shigella Claro, color rosa
Traslcidas en ocasiones opacas. Algunas con centro negro. Las colonias fermentadoras de lactosa son rojas

Color antes de la Medio selectivo inoculacin Agar entrico Hekten Oscuro, color verde

Caractersticas coloniales de Salmonella spp.

Verdes o azul verdes con o sin centro negro. En algunas ocasiones completamente negras

Incubar 18-24h a 37C Bsqueda de colonias tpicas.

Siembra de bioqumicas complementarias: malonato, citrato, RM-VP, UREA, SIM, manitol

Realizar bioqumicas presuntivas Kligler y LIA Incuba r 1824h a 37C

Resultados caractersticos

Incubar 18-24h a 37C

Resultados positivos para Salmonella

Confirmacin Serolgica

Pruebas bioqumicas:

Identificacin de Salmonella spp.

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Pruebas Preliminares

Agar TSI
Amarillo pH<6.4 Rojo pH>8.2

Indicador: Rojo de fenol:

Produccin de H2S:

Citrato de hierro (III) Tiosulfato de amonio

Fermentacin de :
5/19/12 Glucosa

Se espera: Superficie alcalina Fondo cido Precipitado negro

Lisina-Hierro

35 a 37C 24h Enzimas:

Descarboxilasa (cadaverina) Desaminasa Citrato de hierro (III) y amonio Tiosulfato de sodio

H2S:

Prpura de bromocresol:
5/19/12 Amarillo:

pH<5.2

Se espera: Superficie prpura desam (-) Fondo prpura: descarbox

Pruebas Complementarias:
Caldo Urea:

Indicador: Rojo de Fenol:

Amarillo pH<6.4 Rojo pH>8.2 Produccin de NH3 Negativo: amarillo

Enzima Ureasa

Se espera:

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Citrato de Simmons

Indicador: Azul de bromotimol:

pH<6.0=amarillo pH>7.6=azul Citrato permeasa: citrato=carbono Produccin de CO3-2 Y HCO3-1. Medio alcalino

Enzima:

5/19/12 Se espera:

Color

MEDIO SIM:

Sulfuro:

Precipitado negro FeS Tiosulfato reductasa Triptofanasa DMABA: color violeta

Indol:

Movilidad:
Crecimiento 5/19/12 localizado

Se espera: Precipitado negro Movilidad Incoloro al revelar con

Rojo de metilo:

Fermentacin de Glucosa:

cidos Mixtos Descenso del pH pH<4.4=rojo pH>5.1=amarillo Color rojo (+)

Indicador: Rojo de metilo

Se espera:

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Voges-proskauer

Fermentacin de Glucosa:

Butilenglicol No hay cambio de pH Alfa-naftol KOH 40% Sin cambios (-)

Revelador:

Se espera:

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Caldo Malonato:

Malonato:

Fuente de carbono Consumo=alcaliniz acin

Sulfato de amonio:

Negativo: Color verde Indicacor: Azul de (no cambios) bromotimol Positivo: Color 5/19/12 pH<6.0=amarillo azul=alcalinizacin

Fuente de nitrgeno Libera NH3=Alcalinizacin

Caldo Manitol

Manitol:

Carbohidrato fermentable Consumo=acidif icacin

Indicacor: Rojo de fenol

Amarillo pH<6.4 Negativo: rojo Rojo pH>8.2 Positivo: 5/19/12 amarillo=acidificacin

Identificacin Serolgica

Antgeno O H Antgeno Flagelar:

Antgeno somtico

Grupo A Grupo B Grupo C1 Grupo C2 Grupo D Grupo E Grupo F Grupo G 5/19/12

a b c d e,h G complex i Salmonella Tiphy k O(B):H(b) Salmonella Abatetuba O(F):H(k)

Procedimiento, Ag O

SSI

Cultiv o de TSI o LIA

Suero anti Salmo nella O

Agluti nado

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Antgeno H
Incubar bao de agua (50C) c/15min por 1h Agluti nado

Suero antiflagela r 5/19/12 H

Cultivo formalizado Caldo SoyaTripticasena

Industria:

60 muestras de 25g Muestreo: 1 muestra de 1500g 25g muestra individual 225g caldo

5 muestras de 25g, todas deben ser (-) Mejor 1 de 125g 5/19/12

Especificaciones Sanitarias oficiales

Alimentos de bajo En general todos los alimentos deben riesgo: 5 muestras presentar ausencia de Salmonella spp. de 25-30g c/u; por cada 25-30g de muestra ningn positivo. Lo que vara es el nmero de muestras analizadas, de acuerdoAlimentosque al riesgo de presenta el alimento riesgo medio: 1520 muestras de 25-30g c/u; ningn positivo.

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Alimentos con alto riesgo sanitario:

DETECCION DE Salmonella
CULTIVO
Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994 Bacteriology Analytical Manual - FDA

24 h 35 C

25 g

225 ml

Enriquecimiento Selectivo
-

Pre-Enriquecimiento
(Caldo lactosado generalmente)

Caldo tetrationato Caldo selenito Caldo RappaportVassiliadis

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DETECCION DE Salmonella
Enriquecimiento Selectivo
24 h 35 C

Agar Hektoen

Agar XLD

Agar Sulfito - Bismuto

Aislamiento en Agar Selectivo y Diferencial

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DETECCION DE Salmonella
Colonias Tpicas
24 h 35 C

Klebsiella pneumoniae

Proteus vulgaris

Salmonella spp.

Identificacin Bioqumica
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DETECCIN DE Salmonella
Identificacin Bioqumica

Antigeno O (somatico) Antigeno H (flagelar)

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PCR

24 h 35 C

25 g

225 ml

Enriquecimiento: Tetrationato, Selenito, VR

Eliminacion de Interferencias (3 horas en BHI)

BAX

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Normas Oficiales Mexicanas

Cada producto alimenticio tiene sus propias especificaciones sanitarias: NOM-029-SSA1-1993, Productos de la pesca. Crustceos frescos-refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias.

Salmonella spp. en 25g Ausente

NOM-031-SSA1-1993, Productos de la pesca. Moluscos bivalvos frescosrefrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias 5/19/12Salmonella spp. en 25g Ausente

NOM-186-SSA1/SCFI-2002, Cacao, productos y derivados.I Cacao. II Chocolate. III Derivados. Especificaciones sanitarias. Denominacin comercial. Salmonella spp. en 25 g Ausente NOM-036-SSA1-1993, Helados de crema, de leche o grasa vegetal, sorbetes y bases o mezclas para helados. Especificaciones sanitarias. Salmonella spp. en 25 g Ausente NOM-035-SSA1-1993, Quesos de suero. Especificaciones sanitarias. Salmonella spp. en 25 g Ausente NOM-184-SSA1-2002 Leche, frmula lctea y producto lcteo combinado. Especificaciones sanitarias: 5/19/12 Salmonella spp. en 25 g Ausente