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Equipo 8: Acosta Basilio Jos Arturo Aguilar Lpez Aristteles De la Cruz Jimnez Pedro Urbina Soto Jonathan Uriel

OBJETIVOS
Observar y diferenciar hongos de diferentes fuentes, mediante diferentes tcnicas tintoriales. Conocer y aplicar las principales tcnicas de tincin de hongos. Identificar y clasificar los hongos aislados en la practica anterior

Estructura de las clulas fngicas

Las clulas fngicas son eucariotas, poseen ncleo, membrana nuclear perfectamente definida, as como mitocondrias y retculo endoplasmico.

Estructura de la pared de los hongos

Quitina Glucanos Protenas Polmeros de galactosamina Polmeros de manosas (mananos).

Tipos de colorantes

CATIONICOS ANIONICOS

CATIONICOS
Son molculas cargadas positivamente (cationes). Se combinan con los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.

ANIONICOS

Son molculas cargadas negativamente (aniones) Se combinan con muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; su uso es para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.

Clasificacin de tcnicas de tincin

Simples (un colorante)
Azul de metileno. Safranina. Eritrocina. Anaranjado de acridina. Azul se algodn y de lactofenol

Diferenciales (2 o mas colorantes) Especiales (estructuras especficas)

Gram. Acido peryodico de Schiff Giemsa Wright

Tinta china. Gomori-Grocott . Blanco de carcoflour

Reactivos Reactivo Hidrxido de potasio al 10% Composicin KOH Agua destilada Uso 10g Solucin aclarante para 90mL exmenes en directos. Tambin se usa al 20% 10g 10mL 80mL Solucin aclarante para exmenes en directos. Tarda ms en evaporarse

Hidrxido de potasio glicerinado

KOH Glicerina Agua destilada

Hidrxido de potasio azul Parker

KOH Agua destilada Tinta azul Parker

10g Aclarante para exmenes en 90mL directos de pitiriasis versicolor 10mL e infecciones por Pityrosporum sp 0.5mL Para tincin de cido alcohol resistencia en actinomicetos(Nocardia)

Alcohol cido (modificado de Ziehl Neelsen)

cido sulfrico Etanol (96) 99.5mL

Lugol

KI Agua destilada

1g 100mL

Solucin de contraste, para exmenes en fresco de exudados y secreciones.

Colorantes Colorante Azul algodn actico Composicin Azul de algodn cido actico Agua destilada Azul de algodn(de anilina) Glicerol Fenol(cristales) cido lctico Agua destilada 0.5g 3mL 97mL 0.05g 40mL 20g 20mL 20mL Uso Como colorante de microcultivos

Azul de lacto-fenol

Exmenes directos de las cepas

Azul de metileno

Azul de metileno Alcohol etlico (95%) Agua destilada

Azul de tripano Agua destilada

0.3g 30mL 70mL

1g 100mL 2g 20mL 0.9g 80mL

Como colorante de contraste en tinciones de AAR, o para exmenes directos de las cepas
Colorante de microcultivos Colorante de Gram

Azul de tripano

Solucin de cristal violeta Cristal violeta Etanol (95%) Oxalato de amonio Agua destilada

Eritrocina

Fucsina bsica o carbn fucsina

Solucin de Giemsa

Safranina

Colorante de Wright

Eritrocina Alcohol etlico Agua destilada Fucsina bsica Alcohol etlico Fenol (cristales) Agua destilada Giemsa Glicerol Metanol absoluto Safranina Etanol Agua destilada Colorante de Wright Glicerol Metanol absoluto

2g 1mL 98mL 4g 20mL 8g 100mL 1g 66mL 66mL 0.25g 100mL 900mL 0.30g 3mL 97mL

Colorante de microcultivos

Tincin AAR de micobacterias y Nocardia

Tinciones diversas

Colorante de Gram Exmenes directos Tinciones diversas

Etanol Formol

cido perydico 1%

Formaldehdo 40% 10mL Etanol absoluto 90mL cido perydico Agua destilada Agua destilada Fucsina bsica HCl 1N Bisulfito de Sodio Carbn activado

Tincin de PAS

1g 100mL 200mL 1g 20mL 1g 0.5g

Tincin de PAS

Reactivo de Schiff

Tincin de PAS

Solucin de metenamina-nitrato de plata

Metrenamina3% Nitrato de plata al 5% Borato de sodio 5% Agua destilada

40mL 2mL 3mL 35mL

Tincin de Gromori-Grocott

Azul de metileno
UTILIDAD: Para exmenes en fresco o coloraciones compuestas.

FUNDAMENTO: Los hongos adquieren un color azul semejante al azul de algodn, aunque el hongo se observa mas intenso que el fondo del campo.
COMPONENTES

Azul de metileno 0.3g. Colorante Agua destilada 100ml

Mucor sp

Safranina
UTILIDAD: Para el estudio de cultivos y productos biolgicos lquidos.

FUNDAMENTO: Los elementos fngicos se tien de color rojo intenso, y el resto del campo toma un tono incoloro o rosa plido.

Rihizopus sp

Penicillium sp.

Aspergillus sp.

Eritrocina
til para la observacin de grnulos causados por: Nocardia Madurella grisea Madurella mycetomatis

Granos de micetoma por Nocardia sp.

Anaranjado de Acridina
Colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto.

Tincin de ascosporas de Sowerbyella rhenana en naranja de acridina

Composicin
Etanol absoluto cido actico Anaranjado de acridina Buffer de fosfatos Cloruro de calcio
Candida albicans

Azul de algodn
COMPONEN TES Fenol FUNCIN Destruye la flora acompaante.

cido lctico Conserva las estructuras fngicas al provocar un cambio de gradiente osmtico con relacin al interior del fngico generando una pelcula por as llamarlo protectora. Azul de lactofenol El colorante es fuertemente cido y se usa para la tincin directa de micelio miclico, el cual toma un delicado color azul claro. Agente humectante.

Glicerol

Microsporium canis

Rihizopus sp.

Absidia corymbifera

Aspergillus sp.

Tincin de Gram
UTILIDAD: Se emplea para teir: - Productos biolgicos lquidos - Exudados de lesiones - Macerados de biopsias - Todos los hongos son positivos a la coloracin de Gram, excepto Cryptococcus neoformans.

Candida albicans

Tincin Ziehl-Neelsen (acido-Alcohol-Resistentes)

UTILIDAD til en algunos microorganismos cido resistentes como N. asteroides, N. brasiliensis y otros actinomicetes.
FUNDAMENTO El contenido lipdico de estos organismos esta compuesto principalmente por ceras y fosfolpidos que alcanzan hasta un 40 % de su peso seco total .

Grano de Nocardia sp.

Grano de Actinomadura madurae .

Actinomyces Israelii

Tcnica de Schiff PAS

FUNDAMENTO - En la tincin PAS se trata el material con cido perydico, que oxida los 1,2-glicoles formndose grupos aldehdo en los glucanos y mananos de las paredes celulares de los hongos
Coccidioides immitis

- Con el reactivo de Schiff, los aldehdos reaccionan dando un color rojo luminoso.

Reactivo de schiff
Composicin Reactivos Agua destilada Fucsina bsica HCl 1N Bisulfito de sodio Carbn activado Proporcin 200mL 1g 20mL 1g 0.5g

Hystoplasma Capsulatum

Tincin de Giemsa y Wright

- Utilizada para levaduras intracelulares, que generalmente se encuentran dentro de los macrfagos o monocitos - Forma un halo alrededor de la pared celular - Citoplasma se tie de azul celeste - Un polo se tie de azul oscuro (media luna)

Blastomyces dermatitidis. Aspirado de tejido de perro, tincin Wrigth

Hystoplasma capsulatum

Tincin negativa con tinta china

Fundamento Es ideal para observar inclusiones refrctiles que no se tien fcilmente, tales como grnulos de azufre, cido poli-B-hidroxibutirico, esporas o capsulas. Componentes: Tinta china de buena calidad (nigrosina, tinta Pelikan India Ink o Parker Black Ink, entre otras).

Utilidad - Esta tincin especial para visualizar a Cryptococcus neoformans. - La tinta china se emplea en una dilucin de 1:2 con agua destilada (suspensin de coloidal de carbn o nigrosina)

Tincin de Gomori-Grocott (Metenamina de plata)

Fundamento Esta basada en que presencia de acido crmico, los grupos hidroxilo de lo polisacridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehdos; estos a su vez, reducen el complejo nitrato- plata metenamina produciendo la coloracin caf a negra, debido de la plata reducida en los lugares de localizacin de los aldehdos

Tincin DE GROCOTT-GOMORI
Con esta tcnica los hongos se tien de color negro al igual que unas bacterias (Nocardia y Actinomices) la mucosa adquiere un color gris oscuro; las partes internas del micelio rosa oro; el fondo aparece de color verde claro.

C. neoformans

Blanco de carcoflour
Fundamento El calcoflor es un flourocromo que se une a polisacridos con los enlaces beta 1-3 y beta 1-4 presentes en polmeros tales como celulosa y la quitina. El colorante fluorece cuando se expone a una fuente de luz ultravioleta de onda corta o capaz de producir la luz azul (longitud de onda 410-450 nm). Es un mtodo de alta sensibilidad para definir claramente los elementos micoticos con microscopio de fluorescencia

Reactivos - Calcoflour blanco M2R (polysciences) - Azul de Evans

TINCIN CON SAFRANINA

Cubrir el portaobjetos con safranina por 30 segundos.

Lavar con agua y dejar secar.

Observar al microscopio a 10, 40 y 100x.

TINCIN AZUL DE METILENO

Cubrir el portaobjetos con solucin saturada de azul de metileno por 30 segundos. Lavar con agua y dejar secar.

Observar al microscopio a 10, 40 y 100x.

TINCIN CON AZUL DE ALGODN-LACTOFENOL

Colocar una gota de azul de algodn en el portaobjetos

Con el asa micolgica fragmento de la colonia

colocar un

Montar la preparacin colocando un cubreobjetos

Sellar con esmalte para uas incoloro

Observar al microscopio a 10 y 40x.

TINCIN CON ERITROCINA

Fijar la muestra con alcohol metlico por 10 min.

Cubrir la muestra eritrocina por 15 min. R

con

Pasar por alcohol al 70% y dejar secar

Lavar con agua de la llave

Colocar en xilol 15 min. y dejar secar Pasar por alcohol absoluto 5 min. y dejar secar Montar en blsamo de Canad Observar al microscopio a 10 y 40 x.

TINCIN DE GRAM
Cubrir el frotis con cristal violeta por 1 minuto

Aplicar lugol por 1 min.

Lavar con agua y secar

Lavar con agua y secar

Decolorar por 15 seg. Con mezcla alcohol-acetona

Contrastar con safranina durante 30 segundos

Lavar con agua y secar

Lavar con agua y secar

Observar al microscopio a 10, 40 y 100x.

TINCIN DE GIEMSA
Cubrir el frotis con metanol durante 3 min. Dejar secar

Colocar la preparacin en colorante de Giemsa durante 30 min.

Secar, y lavar la preparacin con solucin buffer por 3 minutos. Dejar secar.

Observar al microscopio a 10, 40 y 100x.

TINCIN CON TINTA CHINA

Fijar el frotis directo a la flama

Teir con fucsina bsica durante 1 min.

Lavar con agua

Colocar tinta china en un extremo y extenderla. Dejar secar.

Observar al microscopio a 10 y 40x.

Referencias
Lur de Calafell MC, et al, Introduccin al estudio de la micologa. Argentina: Universidad Nacional del Litoral; 1997 Bonifaz A, Micologa mdica bsica. 2ed. Mxico: Mndez Editores; 2000 Arenas R. Micologa mdica ilustrada. 2ed. Mxico: McGraw Hill; 2003 LopezMartinez,MicologaMdicaProcedimientoparaeldiagnosticodel aboratorio,Ed.Trillas,Mxico2006Capitulo10Pag.149-158 F.J.Baker,ManualdeTcnicasdeMicologaMdicaEditorialAcribia,S. AZaragozaEspaa1998pag.18-20;40-41-Dr. Norman F. Connan; Micologa; Editorial Interamericana S.A de C.V 3ra Edicin Mxico 1972 pag. 557-569 Lynch, M; Raphael, S. Mtodos de Laboratorio. Editorial Interamericana. 2edicin. Mxico. 1987. Tomo II pag. 523-530 MURRAY, G. Microbiologa Mdica. Edit. El Manual Moderno. 3edicin Mxico D.F. 1997 pag175-182