Comparao DA EFICINCIA DE FIXADORES de PROTOZORIOS, UTILIZADOS em estudos ecolgicos DE AMBIENTES AQUTICOS, EM 1* ALVES, H. C.; 1REGALI-SELEGHIM, M. H; 1HAYASHI, L.H.

; 1BUENO, B. G.; 1HISATUGO, K. F.; 1PIEROZZI, M.. funo do pH das amostras 1Universidade federal de So Carlos (UFSCar) - Rod. Washington Lus, Km 235, CEP 13565-905 So Carlos/SP.
INTRODUO
* henriquebiotec@uol.com.br
Cloreto de Mercrio (Hg Cl2)
Protozorios so organismos eucariticos reconhecidos como importantes componentes de ecossistemas aquticos. So relativamente pequenos, frequentemente possuem grande mobilidade e, por no terem parede celular, possuem grande plasticidade e so sensveis manipulao (p.ex. filtrao), caractersticas que dificultam a identificao e contagem em estudos ecolgicos. Alm disso, nestes estudos, a anlise imediata de amostras vivas nem sempre possvel, sendo uma alternativa a utilizao de fixadores para a preservao das mesmas. Na literatura vrios fixadores so mencionados, mas no existe consenso MATERIAL ESabendo que o pH das amostras pode quanto ao melhor. MTODOS alterar a eficincia da fixao, este estudo teve como objetivo testar in vitro a eficincia de alguns fixadores em diferentes pHs. Em cada cavidade de placas de cultivo de tecido foram inoculados 5 indivduos da espcie Paramecium caudatum em 1 mL de uma suspenso da bactria Enterobacter aerogenes (contendo um gro de arroz com casca) em gua mineral corrigida para diferentes pHs (3, 5, 7, 9 e 11), em triplicatas. Esses experimentos, em trplicas, foram incubados a 30oC e aps 72 horas, quando as amostras integrais foram retiradas e preservadas com diferentes fixadores (cloreto de mercrio, lugol cido, bouin, lugol alcalino/ formaldedo/ tiossulfato de sdio (Na2S2O3)e formaldedo a 2%). Os ciliados foram contados em microscpio tico Leica DM/LS no aumento de 40 X com o auxlio de cmara de Sedgewick-Rafter. Como controles foram feitos cultivos, em trplicas, no mesmo perodo, em condies idnticas s anteriormente citadas. Todo o contedo destes cultivos foi contado diretamente (microgotas) em microscpio tico Leica DM/LS, no aumento de 40 X sem fixao, aps 24, 48 e 72 horas para avaliar isoladamente o efeito do pH na densidade e sobrevivncia dos organismos.
Densidade celular Densidade celular
30 350 310 270 230 190 150 110 70 30 -10

Lugol cido
Densidade celular

10

-10

Bouin
350 310 270 230 190 150 110 70 30 -10

Lugol alcalino /Formol /Na2S2O3

350 310 270 230 190 150 110 70 30 -10

Formaldedo a 2%
350 310 270 230 190 150 110 70 30 -10

Densidade celular

Densidade celular

Figura 1 E DISCUSSO 2 RESULTADOS Figura Placa de Material cultivo de fixado. tecido (24 cavidades).
Mdias das contagens diretas
10

Densidade celular

Figura 4 Grficos RESULTADOS E CONCLUSES comparativos entre contagens diretas e material fixado (ambos aps 72 h de cultivo).

Tempo (h)

Figura 3 Crescimento mdio das culturas (valores em destaque na tabela 1). Tabela 1

Desv. 24 h Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3 Mdia Pad. pH 3 0 0 0 0,00 0,00 pH 5 25 28 33 28,67 4,04 pH 7 18 24 21 21,00 3,00 pH 9 33 22 19 24,67 7,37 pH 11 26 19 17 20,67 4,73 Desv. 48 h Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3 Mdia Pad. Finlay, B. J., Laybourn, J. & Strachan, I. A technique for the enumeration pH 3 4 0 0 1,33 2,31 of benthic ciliated protozoa. Oecologia , 39: 375-377, 1979 pH 5 57 104 78 79,67 23,54 Madoni, P. & Romeo, M. G. - Acute toxicity of heavy metals towards pH 7 67 110 107 94,67 24,01 freshwater ciliated protists. Environmental Pollution, 141: 1-7, 2006. pH 9 15 71 114 66,67 49,64 pH 11 25 38 207 90,00 101,53 Nalecz-Jawecki, G. - Spirotox- Spirostomum ambiguum Acute Toxicity TestDesv. 10 years of experience. Environmental Toxicology, 19: 359-364, 2004. 72 h Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3 Mdia Pad. Nicolau, A. et al. - Os protozorios como ferramenta da monitorizao pH 3 0 0 0 0,00 0,00 biotecnolgica da poluio: ensaios in vitro: 1-10, 1999. pH 5 45 29 17 30,33 14,05 WIACKOWSKI, K., DONIEC, A. & FYDA, J. An empirical study of the effect of pH 7 60 115 2 59,00 56,51 pH 9 31 97 45 57,67 34,78 fixation on ciliate cell volume. Marine Microbial Food Webs, 8 (1-2): 59pH 11 131 120 145 132,00 12,53 69, 1994. Apoio Financeiro: Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo

O fixador que, em mdia, preservou a maior quantidade de clulas no pH 5 foi o bouin (69,00 clulas . mL-1), no pH 7 foi o lugol cido (130,67 clulas . mL-1) e nos pHs 9 e 11 foi o cloreto de mercrio (135,33 e 227,67 clulas . mL-1 respectivamente), entretanto, considerando a densidade mdia em todos os pHs, o cloreto de mercrio foi o melhor fixador (123,25 clulas . mL-1), dentre os testados, e o lugol alcalino (35,33 clulas . mL-1) e o formaldedo a 2% (17,42 clulas . mL-1) foram os piores. O fato de encontrarmos maiores densidades nos experimentos preservados com alguns fixadores (HgCl2, Lugol cido e Bouin) em comparao aos controles mostra a eficincia desses mtodos de fixao e as deficincias do mtodo de contagem direta provavelmente pelo excesso de manipulao da amostra. Nas contagens diretas, foi observado que P. caudatum no sobrevive ao pH 3 nessas condies de cultivo. Considerando os experimentos no fixados, a maior mdia da densidade celular em 24h de cultivo foi obtida no pH 5 (28,67 clulas . mL-1), em 48h no pH 7 (94,67 clulas . mL-1) e em 72h no pH 11 (132,00 clulas . mL-1). Com exceo do pH 3, entre 0 e 48h houve aumento na densidade populacional de todos os cultivos, entretanto, entre 48 e 72h houve decrscimo no nmero mdio de indivduos cultivados nos pHs 5, 7 e 9, sendo que apenas nos cultivos do pH 11 a mdia populacional aumentou. Tais resultados indicam que esse protozorio tem ampla faixa de tolerncia (do pH 5 a 11) e que, com o passar do tempo, provavelmente o acmulo de metablitos nos Referncias bibliogrficas experimentos reduz o pH do meio favorecendo, a longo prazo, os cultivos iniciados com pH maior.