TCNICAS EN EL ANLISIS DE MICROSATLITES UTILIZADOS EN IDENTIFICACIN HUMANA

ENSAYOS DE IDENTIFICACIN HUMANA

Casos forenses : apareamiento de evidencia y sospechoso Test de paternidad Investigaciones histricas Investigaciones de personas desaparecidas Desastres en masa Base de datos de convictos

ADN como evidencia ...

99 99.9% del ADN humano es idntico de persona a persona 1 0.1% del ADN humano diferente es usado en mtodos de identificacin Huella genmica o fingerprinting

escena del crimen o de una prueba de paternidad

Extraccion de ADN

Pasos en el procesamiento de una muestra Muestra obtenida de la de ADN

Biologa
Cuantificacion de ADN Amplificacin PCR de marcadores STRs

Tecnologa
Separacin y Deteccin de productos PCR ( Alelos de STRs) Determinacin genotipo muestra

Comparacin del genotipo de la muestra con otros resultados

Gentica

Entrega de resultados (clculos estadsiticos)

Anlisis de los resultados (comparacin con datos poblacionales)

MARCADORES MOLECULARES
En anlisis forense de ADN se utilizan:
RFLPs VNTRs STRs SNPs ADN mitocondrial ADN cromosoma Y

CARACTERISTICAS MARCADORES MORFOLOGICOS

Recesivos en la naturaleza Problemas con dominancia incompleta, epistasis, baja penetrancia Mutaciones causan fenotipo deletreo Influenciados por el medio ambiente Fenotipo transitorio Difcil para combinar

CARACTERISTICAS DE UN MARCADOR POLIMORFICO IDEAL

Expresin codominante Ensayo no destructivos Penetrancia completa Alto polimorfismo Distribucin al azar a lo largo del genoma Ensayos automatizados

Comparacin de los mtodos de tipificacin

RFLPs
Tiene alto poder de discriminacin 20-80 alelos diferentes (una localizacin) Combinacin varios usado determinar un tipo individualizado. Mtodos de anlisis de RFLP extensos Sondas multi-locus difciles de automatizar Requiere una amplia cantidad de ADN sin degradar.

MTODOS DE IDENTIFICACIN
Souther blot Aislar ADN Digestin ADN con ENZIMA restriccin Fragmentos de ADN electroforesis SONDA Membrana

VNTRs
Forma variable de los RFLPs Repeticiones en tandem de nmero variable Minisatlites (10 100 pb) Diferencias en el nmero de repeticiones pueden ser detectadas por diferencias de longitud

MICROSATELITES (STRs)
Secuencias repetidas en tandem de 2-7pb. Variacin en longitud (unidades de repeticin) Utilizados en diversos campos: Identificacin gentica humana Diagnstico predictivo enfermedades base genticaSTRs (2- 7 pb) Muy frecuentes y repartidos por todo el genoma eucaritico Modelo de herencia mendeliano, codominantes y multiallicos Altamente polimrficos: Variacin en la longitud (N repeticiones)

MICROSATELITES (STRs)
GATA

11 repeticiones

10 repeticiones

La region de repeticin es variable entre las muestras mientras que las regiones flanqueantes donde se alinean los primers son constantes.

Longitud de la unidad de repeticin

Mononucletido Dinuclotidos Trinucletidos Tetranucletidos (AGAT or GATA) Pentanucletidos Hexanucletidos

ANALISIS DE STRs
Pequeas cantidades de ADN ADN degradado Se pueden analizar por medio de PCR: < 350 pb: anlisis por PCR Utilidad Identificacin individual Caracterizacin gentica de las razas

SNPs (polimorfismo de nucletidos simples)

AMPLIFICACION DE ADN CON LA TCNICA DE PCR

5 5 3 3
Cadenas separadas (denaturacin)

3 3 5 5 DNA MOLDE

Forward primer

3
Copias (extensin Adicin de de primers ) primers 5 (alineamiento)

Reverse primer

Multiples copias de ADN por PCR

Original DNA target region

Thermal cycle

En 32 ciclos con un 100% de eficiencia se pueden producir hasta 1.07 billones de copias de ADN molde

Multiplex PCR
Se pueden analizar hasta 10 loci simultneamente Alta sensibilidad menos de 1 ng de ADN Util en anlisis de muestras degradadas y de mezclas Ventajas: disminuye costos, tiempo, contaminacin del ADN

MULTIPLEX PCR
Diferentes marcadores fluorocromos pueden ser usados para el anlisis de loci donde se sobrelapan el tamao de los alelos Separacin de productos PCR: TIPIFICACION MANUAL: Tincin de nitrato de plata DETECCION FLUORESCENTE SEMIAUTOMATICA Electroforesis capilar Electroforesis en geles de poliacrilamida

EJEMPLO DE UN KIT DE MULTIPLEX

AmpFlSTR Profiler Plus
100 pb 200 pb 300 pb 400 pb

Separacin por color

Separacin por tamao

D3 A D8 D5

vWA D21

FGA D18

5-FAM (blue) JOE (green) NED (yellow) ROX (red)

D13

D7

Estandar interno GS500

9 STRs amplificados junto con Amelogenina en una sola reaccin de PCR

Amplificacin de Mltiplex

OPTIMIZACION DE LAS TEMPERATURAS

Activacin prePCR T desnaturalizacin T alineamiento T extensin Extensin Final 95C 12 15 min 95C 30 60 seg Depende de Tm 72C 20 60 seg 72C 7 10 min

PROBLEMAS Y SOLUCIONES
Que hacer cuando se obtienen fragmentos inespecficos de largo tamao? Disminuir el t de alineamiento Aumentar la T de alineamiento Disminuir el t de extensin Disminuir la T de extensin Disminuir la cantidad de primer, ADN molde, taq polimerasa Chequear los primers en BLAST Combinar algunas o todas las anteriores

Cuando los fragmentos de ADN alcanzan la ventana capilar, el lser excita los colorantes fluorescentes. La fluorescencia emitida por los colorantes es colectada por el detector a longitudes de onda particulares y registrados como seales digitales en el computador.

El instrumento de secuenciacin automtica genera un cromatograma mostrando la emisin de los fluorocromos cuando ellos pasan por el detector en el instrumento. El orden de estos colores corresponde a el orden de las bases en el ADN. As una secuencia de ADN puede ser leda directamente desde el cromatograma.

Cuntos alelos distintos se pueden detectar por cada individuo heterocigtico, empleando una sonda de locus nico, en un anlisis de huella dactilar de ADN? a. b. c. d. 1 2 4 8

Los alelos VNTR que se analizan en los experimentos de huella dactilar de ADN son altamente variables entre individuos. En qu difieren entre s los numerosos alelos VNTR de un mismo locus? A. En el nmero de sitios internos de corte para la endonucleasa de restriccin HaeIII. B. En el nmero de genes que codifican protenas. C. En el nmero de sitios de metilacin del ADN. D. En el nmero de veces que se repite una secuencia sencilla de ADN.

En qu mtodo habitual de biologa molecular se basa el anlisis de alelos VNTR en el estudio medicolegal de perfiles de ADN? A. Clonacin B. Imunotransferencia C. Reacciones de PCR D. Hibridacin de Southern

Se usan clculos de probabilidad en las aplicaciones medicolegales de la huella de ADN para determinar si:
A. El ADN de dos orgenes diferentes tiene alelos coincidentes. B. Las muestras de ADN se han degradado antes del anlisis. C. Una coincidencia entre alelos de muestras diferentes de ADN puede ser casual. D. Una muestra desconocida de ADN procede de un varn o de una mujer.

Conclusiones
Se dispone de muchos tipos de marcadores Escogencia de los marcadores para estudios de identificacin dependen de muchos factores. Todos los marcadores moleculares no son iguales. Ninguno es ideal. Algunos son mejores que otros.