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Dra. Ela Alvarado A.

CONTENIDO
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Revisin de los cidos nucleicos: organizacin, estructura y funciones. ARN : transcripcin y sntesis de protenas El gen: naturaleza y propiedades. El cdigo gentico nuclear, propiedades. El ADN mitocondrial: Caractersticas y propiedades. Mapa del ADNm. Variacin en la expresin de los genes : penetrancia y expresividad, pleitropa, heterogeneidad gentica y expresividad de los genes y otros. Mtodos y tcnicas del ADN : * Tcnicas de Southern Blood, PCR, * El ADN recombinante : aplicaciones 8. El Genoma humano : Mapeo de cromosomas, mapa gentico y mapa fsico 9. Las mutaciones : Tasa de mutacin, mutaciones a nivel molecular, clasificacin de las mutaciones

MODELO DE UN CROMOSOMA HUMANO MOSTRANDO SUS NIVELES DE ORGANIZACIN

COMPONENTES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS


BASES: A. PURICAS
ADENINA (6-aminopurina) GUANINA (2-amino-6-oxipurina)

B. PIRIMIDICAS

TIMINA (5-metio-2,4-dioxipiridina)

URACILO (2,4-dioxipirimidina)

CITOCINA 2-oxi-4-aminopirimidina

COMPONENTES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

AZUCARES

DNA contiene desoxirribosa


RNA contiene ribosa FOSFATO

DESDE LOS GENES A LAS PROTEINAS

UNIDAD DE TRANSCRIPCION DEL ADN (Cadena peptidica de la Globina Humana)

RNA SPLICING

TRADUCCIN Y SNTESIS DE PROTENAS

EL CODIGO GENETICO NUCLEAR

PROPIEDADES DEL CDIGO GENTICO


1. Es universal 2. Es degenerado

3. Es lineal
4. La unin de bases es especfica 5. Es un cdigo de tripletes 6. El codn que inicia un gen el AUG (metionina) 7. Los codones de terminacin de un gen son: UUA, UAG, UGA. 8. Es variable 9. Es estable 10. Es una estructura totalmente decifrada (se basaron en la snteiss de cadenas de polinucltidos desiguales, ej. UUU- Phe-.

EL GEN: PROPIEDADES
Capacidad de dirigir la formacin de una rplica exacta de s mismos.
Capacidad de mutar, esto es, de sufrir alteraciones sin perder la capacidad de reproducirse. Capacidad de dirigir la formacin de enzimas u otras protenas.

En cada opern se diferencian dos clases de genes

1.
2.

Genes estructurales codifican enzimas (E1, E2, E3, ...)


Gen regulador, codifica una protena represora (PR) que puede encontrarse en la forma activa (PRa) o inactiva PRi). Agente que controla la expresin.

Adems otras regiones:


Promotor (P), zona donde se une la ARN polimerasa. Operador (O), zona reconocida por la proteina represora activa. Cuando la PRa se une al O, bloquea el avance de la ARN polimerasa.

VARIACIONES EN LA EXPRESION DE LOS GENES


Penetrancia y Expresividad : * Penetrancia : Capacidad del gen para alcanzar una expresin. Penetrancia reducida : Algunos individuos que poseen el genotipo apropiado no expresan este carcter.Ejm.Retinoblastoma (tumor ocular m.)HAD * Expresividad : Gama de fenotipos que proceden de un determinado genotipo. Expresividad variable: Ejm. Neurofibromatosis tipo I, Campodactilia, Fibrosis qustica, Osteognesis I.

RETINOBLASTOMA
( Penetrancia reducida)

EXPRESIVIDAD VARIABLE: ( Campodactilia )

EXPRESIVIDAD VARIABLE : Albinismo

Pleitropa : (Un gen varios efectos). * Genes pleitrpicos: Efectos fenotpicos mltiples causados por un solo gen mutante o por un par de genes. - Sndrome de Marfn (mutacin de un solo gen produce patologa en ojos esqueleto y sistema cardio vascular) Cromosoma 15q (gen codificador de la fibrilina). - Fibrosis qustica: ( puede afectar glndulas sudorparas pulmones y pncreas).Cromosoma 7q31 - Anemia de clulas falciformes.(eritrocitos ,hueso y bazo)

PLEITROPIA : S. de Marfan

Heterogeneidad gentica : (Varios genes un solo


efecto)
* Osteognesis Imperfecta : ( AD y AR) Mutacin de genes causa estructura anormal de la triple hlice del procolgeno. Codificado por 2 genes ( crom.17 y otro en el crom.7 ). Sndrome de Waardenburg :(sordera profunda infantil con alteraci pigmentarias causados por diferentes genes recesivos en diferentes loci.(padres recesivos tienen hijos de3 tipos : todos sordos, todos oyentes y otros sordos y oyentes). Heterogneidad en las diferentes distrofias musculares: - Duchenne y tipo Becker ligados a X, - Distrofia muscular risomlica AR , - Distrofia muscular facioescpulo humeral AD. (con formas frustradas, unas ms severas que otras.)

HETEROGENEIDAD GENETICA: (varios genes un solo efecto) Osteognesis I

HETEROGENEIDAD GENETICA ( S. de Waardenburg )

HETEROGENEIDAD : (En las distrofias musculares)

CARACTERES INFLUIDOS POR EL SEXO :


( expresados en ambos sexos y con frecuencias diferentes)

Fenotipo Calvicie
Hiperplasia suprarrenal congenita Hemocromatosis Hipogonadismo Miopa limitada a las mujeres Pubertad precoz

Genetica

Diferencia sexual AD en v Gran exceso en varones


Se reconoce mas a menudo en mujeres Exceso en varones Limitado a varones Limitado a mujeres Limitado a varones

AR en m AR AD AR

AD
AD

CARACTERES LIMITADOS POR EL SEXO ( Pubertad precoz )

Nios afectados son mas altos que los de su edad, pero pronto interrumpen su crecimiento y son bajos). Difcil de diferenciar de la HR ligada a X.

CARACTERES LIMITADOS POR EL SEXO (S. de Feminizacin testicular)

Frmula cromosomica : 46, XY Tipo de herencia: AR ligado a X

EDAD Y EXPRESION DE LOS GENES:


Muchos genes actan antes del nacimiento o en las primeras fases del desarrollo Cuando el nio comienza su vida independiente puede ser afectado: fenilcetonuria, galactosemia (enfermedades metab.) Corea de Huntington : HAD, locus 4p 16.3, Gen CAG 30-35 (premutantes). repeticiones de 35 a 40 (mutantes).

ADN MITOCONDRIAL (ADN mt)

PROPIEDADES DEL ADNmt


Doble hlice pequea de 16,579 pb. Forma circular, contiene 37 genes para 22 ARNt. Sus codones de terminacin no estn codificados por el propio ADNmt. Parece que codifica solo algunas protenas mitocondriales. Las enzimas implicadas en su replicacin, transcripcin y traduccin son codificadas por genes nucleares. Tiene distribucin asimtrica de G y C generando: Una cadena pesada (H) rica en G Otra cadena ligera (L) rica en C.

DIFERENCIAS CON EL ADN NUCLEAR


UGA AUA Codifica para triptofano y no para terminacin Codifica para metionina en vez de isoleucina

AGA y AGG

Actan como codones de terminacin en vez de codificar arginina.


Actan como codones de inicio junto a AUG

AUA y AUU

A=ATPasa; CO=Citocromo oxidasa; Citb=Citocromo b, ND=NADH-coenzima Q reducasa; OH, OL=Orgen de la replicacin de las cadenas H y L; 12S, 16S=ARNr, N/C=Regin no codificadora, ll=ARNt.

TECNICA DEL SOUTHERN

ELECTROFORESIS DE ADN

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Para amplificar cuanto se quiera, segmentos especficos de ADN situados entre los primers que se colocan a ambos lados de la zona que se quiera amplificar

ADN RECOMBINANTE
La tcnica del ADN recombinante son mtodos que permiten cartografiar los genes humanos sin necesidad de conocer la naturaleza del gen ni el producto del mismo. Consiste en la reunin artificial de molculas de ADN o parte de esas molculas que no se encuenran juntas en la naturaleza y provienen de diferentes organismos. Se agrupan en dos reas principales.

1. Las tcnicas del clonado del ADN


2. Los mtodos de anlisis del ADN

REQUISITOS BSICOS PARA CLONAR ADN


1. Un mtodo que permite colocar juntos a porciones de ADN procedentes de distintos organismos. 2. El empleo de una forma de autoreplicacin del ADN conocido como vector de clonacin que se une a un trozo de ADN que se va ha clonar. 3. El traslado de un vector que lleva una porcin de ADN al interior de una clula donde tiene lugar la replicacin.

4. Un mtodo para identificar las clulas que contiene cualquier porcin deseada del ADN.

ENZIMAS DE RESTRICCION
Bacterias de donde se obtienen y secudncias de ADN que reconocn (incluye el sitio donde lo rompen)

ENZIMA
Alul Mspl Hinfl BamHl

BACTERIA
Athrobacter luteus Especies de Moraxella Haemophilus influenzae Rf Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Providencia stuartii

ROMPIMIENTO (*) 5 3 AG*CT GC*CC G*ANTC G*GATCC G*AATTC CTGCA*G

EcoRI Pstl

A=Adenina; C = Citocina; G = Guanina, T = Timina, N = cualquier base

VECTORES DE CLONACIN
Agentes transportadores, son pequeas molculas de ADN con capacidad de autorreplicacin que se utilizan para transferir segmentos de ADN extraos entre clulas husped.
PRINCIPALES VECTORES DE CLONACION 1. 2. PLASMIDOS FAGICOS

3.
4.

COSMIDOS
CROMOSOMAS ARTIFICIALES (YACS)

PLASMIDOS
Son organismos muy sencillos que se encuentran en el citoplasma de las clulas bacterianas. Molculas de ADN circular de tamao menor que un cromosoma. Frecuentemente contienen 1 2 genes que codifican resistencia a los antibiticos.

Fueron los primeros vectores de donacin fciles de aislar y purificar, pueden ser reintroducidos en una bacteria por transformacin. El plsmido ms usado es el pBR322, contiene genes que codifican a la ampicilina y a la tetraciclina y muchos sitios de restriccin.

METODOS DE INTRODUCCION DEL VECTOR

1. Transformacin
La clula capta molculas de ADN que se encuentra en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma

Ocurre espontneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la clula bacteriana a tratamientos fsicos y qumicos.

2. Transduccin.
Consiste en introducir el ADN en una clula hospedadora mediante un virus Se observa: (1) El virus se aproxima a la bacteria llevando un genoma con el gen que le interesa donar. (2) El virus se pone en contacto con la bacteria donde se forma un poro. (3) El virus inyecta su ADN al interiror de la clula bacteriana.

Mtodos de introduccin del vector.


El siguiente paso ser introducir el vector de clonacin que contiene el gen que se quiere clonar en la clula hospedadora. Existen varios mtodos que dependern del tipo de clula fundamentalmente. En bacterias se realiza mediante estos procesos:

El gen es insertado con una fina aguja fabricada por los cientficos.

CROMOSOMAS ARTIFICIALES
Transportan grandes cantidades de material gentico. Por esto son muy tiles en la secuenciacin del genoma.

Cromosoma artificial de levadura: (YACS)(Yeast artifitial chromom * Es uno de los ms utilizados. * Los segmentos de ADN contienen todos los elementos necesarios para propagar un cromosoma en levaduras. * Contienen fragmentos de ADN de 100 a 2000 kb de tama pueden introducirse en clulas de S. cereviciae y sern replicados juntos con los cromosomas verdaderos.

Cromosoma artificial bacteriano:(BAC)(Bacterial artificial chromome)

* Es un vector de donacin alternativo, basados en


plsmidos de fertilidad de E. Coli.

* Facil de reproducir y manipular, no sufre recombinacin con la misma faciliad de los YACS.

* Se insertan un fragmento de ADN foraneo hasta de 30 kb de longitud mediante electroporacin.

APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE


1. RFLP (Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restriccin)

2. CARTOGRAFIA DE LOS PROCESOS HEREDITARIOS


3. PROYECTO GENOMA HUMANO 4. DIAGNOSTICO DE LOS PROCESOS HEREDITARIOS

5. TERAPIA GENICA

ANALISIS DE LOS RFLP


Son variedades de la longitud de los fragmentos de ADN generados por una endonucleasa de restriccin. Se heredan en forma codominante. Los RFLP se usan como marcadores de genes o cromosomas especficos. El fenotipo depende de la obtencion de los fragmentos de ADN que son de diferentes tamaos. Los fragmentos de RFLP se usan para cartografiar un determinado cromosoma empleando hbridos de cromosomas humanos en distintas combinaciones. Los RFLP son de diferentes longitudes en diferentes personas que pueden reconocerse por la movilidad alterada de los fragmentos en la electroforesis.

CARTOGRAFIA DE LOS PROCESOS HEREDITARIOS


Para asignar un gen en un determinado cromosoma, es necesario:

* Una gran familia a cuyo travs se haya transmitido un proceso hereditario.


* Una coleccin de RFLP (almenos 1 de cada cromosoma humano)

PROCEDIMIENTO:
* Anlisis del rbol genalgico para averiguar el tipo de herencia del defecto gentico y para identificar a los afectados. * Pruebas a cada miembro de la familia para averiguar el modelo de herencia de los marcadores de RFLP especificos de cada cromoso. Ejm. DMD: Xp, HE: 4p, QF: 7q, NF1: 17q11.2 NF2: 22

PROYECTO GENOMA HUMANO


OBJETIVO: Determinar la localizacin de los genes que contiene el GH y analizar la estructura de esos genes a nivel de la secuencia de los nucletidos.
PROCEDIMIENTO: * Construir un mapa gentico de alta resolucin de cada uno de los cromosomas. * Utlizando porciones del mapa genetico se elabora un mapa fsico de alta resolucin. * A partir del mapa fsico se obtendr una serie de secuencias yuxtapuestas del ADN clonado. * Se determinar la secuencia de cada uno de esos clones y la secuencia de los nucleotidos conservados en un banco de datos de un ordenador.

EL GENOMA HUMANO

El mapa genetico humano como resultado del estudio conjunto de la investigacin pblica y privada con los 30,000 genes en los 23 pares de cromosomas

APLICACIONES MEDICAS DE LA INGENIERIA GENETICA


* Produccin de protenas de utilidad medica (como la somatostatina, la insulina, la hormona del crecimiento humano, los interferones).

* Utilizacin de plantas desarrolladas mediante ingeniera gentica para producir vacunas orales.

* Vacunas sintticas (por ejm: vacunas contra el paludismo y la rabia) mediante tcnicas recombinantes.

CLONACION DE MAMIFEROS (OVEJA DOLLY)

1986: se autorizan las pruebas clnicas de la vacuna contra la hepatitis B obtenida mediante ingeniera gentica. 1987: propuesta comercial para establecer la secuencia completa del genoma humano (proyecto Genoma), compuesto aproximadamente por 100.000 genes. 1989:comercializacin de las primeras mquinas automticas de secuenciacin del ADN. 1994: se comercializa en California el primer vegetal modificado genticamente (un tomate) 1997: Clonacin del primer mamfero, una oveja llamada Dolly

cM

MAPA GENETICO DEL CROMOSOMA 1

Marcadores genticos: Son variedades moleculares obtenidos por tecnicas de ADN recombinante

MAPA FISICO DEL CROMOSOMA 1 1,990

CROMOSOMA -1 1,995

MUTACION
Definicin: Es todo cambio en el material gentico que se debe a la variacin gentica de los seres humanos y de otros organismos. Tipos: Microscpica, Submicroscpica (mutaciones de punto) sustitucin de una base por otra en el DNA.

Deteccin: Cmo se produce una mutacin? 1.- En organismos inferiores se pueden disear experimentos. 2.- En el genoma humano son indirectos y deducibles por inferencia (basndose en el Arbol Genealgico)

TASA DE MUTACIN
Definicin: Nmero de veces que se producen alelos mutantes encada locus y en cada generacin. Frecuencia: En humanos es de 10-5 10-6 gametos por generacin Se deben diferenciar : 1.- Mutaciones recientes , 2.- Mutaciones pre-existentes que se producen en el pasado, y permite un fenotipo normal porque: 2.1- Existen genes mutates al fenotipo normal heredado por uno de los padres. 2.2- Las mutaciones dominantes no siempre tienen el 100% de penetrancia, por tanto algunas veces no se expresan. 2.3- Las mutaciones dominantes se detectan fcilmente porque se expresan en estado heterocigoto.

2.4 - Las mutaciones que el propio individuo acumula durante su existencia: * Por mutacin expontnea, debido a mecanismos normales en la duplicacin o reparacin del DNA. * Por mutgenos: fsicos, qumicos y biolgicos. Ejm. Radiaciones que producen transiciones o tranversiones, desaminacin y metilacin. Estudios realizados demuestran que las mutaciones son fenmenos raros en el GH observados en 1/ 1000,000 de copias que genera 6-7 millones de genes mutantes en cada generacin. Disminuye por factores como: * Naturaleza redundante del cdigo gentico, * Carcter recesivo de la mayoria de las mutaciones, * Tasa de muerte temprana que se asocia a muchas enfermedades hereditarias.

MUTACIONES A NIVEL MOLECULAR


Las mutaciones en la molcula del ADN han aportado pruebas que existe una unin directa entre el gen, la proteina y el fenotipo. Las mutaciones pueden aparecer expontneamente como consecuencia de un error en la replicacin del ADN o como resultado de cambio de los tomos en la base de los nucletidos. La mutacin por cambio de lectura produce una modificacin en la lectura de los cdones que suelen acarrear alteraciones espectaculares en la estructura y funcin de los pptidos elaborados.

FACTORES QUE AFECTAN A LA FRECUENCIA DE MUTACIONES EN LOS GENES :


Variaciones se deben a: 1.- Tamao del gen: DMD 2000,000 de Pb .

NF1 2,000 aa = 300,000 Pb


2.- Secuencia de los nucletidos: Xfrgil CGG se repiten de 6 50 veces en no afectados y en afectados > de 50. 3.- Modificaciones qumicas expontneas:Ej. HbA y Hb S

FRECUENCIA DE MUTACIONES EN EL SER HUMANO Rasgos Mutantes/milln Frecuencia de gametos de la mutacin


10 2.6 6 10 50-100 60-120 4-6 <1 50-100 1 x 10 -5 2.6 x 10 -6 6 x 10 -6 1 x 10 -5 0.5-1 x 10 -4 6-12 x 10 -6 4-6 x 10 -6 1.8 x 10 -7 0.5-1 x 10 4

Acondroplasia Aniridia Retinoblastoma Osteogenesis imperfecta Neurofibromatosis Enfermedad poliquistica renal Sindrome de Marfan Sindrome de Von-Hippel-Landau Distrofia Muscular de Duchenne

Secuencia de los ocho primeros aminocidos de las cadenas b de la HbA y HbS. En posicin 6 la HbS tiene Val en lugar de Glu, lo que se debe al cambio de un nucletido del codn GGA en la HbA por GUA en la HbS.
Codn
HbA GUU CAU UUA ACU CCU GGA GAA AAA Valina Histidina Leucina Treonina Prolina Acido glutmico Acido glutmico Lisina

Aminocido

Codn
HbS GUU CAU UUA ACU CCU GUA GAA AAA

Aminocido

Valina Histidina Leucina Treonina Prolina Valina Acido glutmico Lisina

CLASIFICACION DE LAS MUTACIONES


1. Respecto a su mecanismo de Produccin 1.1 En punto Susticiones o Cambio de una base prica o Transiciones pirimidica por otra prica o pirimidica.
Transversiones Cambio de una base prica por una pirimidica o visceversa. 1.2 Fuera de Adiciones fase Deleciones o inserciones Se adiciona 1, 2 o mas bases. Se suprimen 1, 2 o ms bases.

2. Respecto a su Expresin

2.1 Letales
2.2 Subletales

La preencia de la mutacin es incompatible con la vida. El cambio producido por la mutacin permite la vida pero se presentan alteraciones estructurales o funcionales.

2.3 Condicionales El efecto de la mutacin solo se observa en determinadas condiciones, es decir por exposicin a farmacos. 2.4 Somaticas El cambio por la mutacin afecta a algunas estructuras del organismo 2.5 Geneticas La mutacin altera la informacion genetica de los gametos y los descendientes.

3. Respecto al efecto que producen en el organismo que las presenta 3.1 Positivo Confieren al organismo una nueva ventaja respecto a su ambiente, una mayor facilidad de adaptacin o nuevas aptitudes respecto a otro. 3.2 Negativo Pueden restar capacidades de sobrivencia, de adaptacin o estructura. Son los ms frecuentes. Ej. Producen los padecimientos hereditarios (autosmicos recesivos). Pueden o no conferir cambios.

3.3 Neutro

MUTAGENOS
1. FISICOS

* RADIACIONES
- Radiaciones ionizantes (rayos X, rayos a, b, g, etc) - Luz ultravioleta

2. QUIMICOS (Tabaco, alcohol, alquitran, etc)


3. BIOLOGICOS

* Virus (retrovirus)

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