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Spectromtrie de masse

Atelier
Analyse de spectres de masses issus
du couplage chromatographie-MS

1. Ions molculaire et pseudo-molculaire

2. Massifs isotopiques

3. Rsolution

4. Fragmentations et rgle de lazote

5. Ions pseudo-molculaires multichargs
et formation dadduits
Analyse de SM issus du
couplage chromatographie-MS
analyse de spectres de masse
3
Ion molculaire = radical-cation* provenant de larranchement dun
lectron la molcule neutre : M
+ -
(masse M, charge +1)
Ion molculaire ou pseudo-molculaire
Source
dionisation :

Impact
lectronique (EI)
Ion pseudo-molculaire :
En mode positif : ajout dun proton sur M : (M+H)
+
(masse : M+1, charge+1)
En mode ngatif : perte dun proton : (M-H)
-
(masse : M-1, charge -1)
Ions pseudo-molculaires multichargs (voir plus loin)
!! Le pic rechercher diffre selon la source dionisation
La plupart des
sources
(CI, APCI, ..)
Electrospray
(ESI)
* La notation M
+ -
signifie quil sagit de la molcule entire (aprs perte dun lectron), quelle est
charge positivement (+), et quelle comporte un lectron non appari (-)

analyse de spectres de masse
4
Ion pseudo-molculaire :
Exemple : analyse HPLC/APCI dun mlange de 5 benzodiazpines
(Solvant = CH
3
CN-H
2
O)
287
300
271
309
285

1. Ions molculaire et pseudo-molculaire

2. Massifs isotopiques

3. Rsolution

4. Fragmentations et rgle de lazote

5. Ions pseudo-molculaires multichargs et
formation dadduits
Analyse de SM issus du
couplage chromatographie-MS
analyse de spectres de masse
6
1. Massifs isotopiques

Isotopes : atomes dun mme lment qui contiennent un nombre identique de protons
mais un nombre diffrent de neutrons

Abondance isotopique = pourcentage des isotopes dun lment dans la nature

Masse moyenne pondre (MM) = Masse atomique apparaissant sur le tableau priodique
et qui tient compte des isotopes et de leur abondance

Exemple : nbre de nbre de
protons : nuclons :
nbre nbre de nbre masse abondance abondance
atomique masse neutrons isotopique en %
(1)
relative
(2)

Chlore-35 17 35 35-17 = 18 34,97 75,8% 100
Chlore-37 17 37 37-17 = 20 36,97 24,2% 32,5


Masse moyenne pondre du chlore = (0,758 * 34,97 uma) + (0,242 * 36,97 uma) = 35,454 uma

(1)
= nombre moyen disotope cit pour 100 atomes de llment
(2)
= nombre moyen disotope cit pour 100 isotopes majoritaires
analyse de spectres de masse
7
Principaux isotopes en chimie organique
N.B. Pour une liste complte des isotopes de tous les lments : voir fichier excel sur www.ipl.be
Elment isotope % Masse
isotopique
isotope % Masse
isotopique
isotope % Masse
isotopique
Masse
moyenne
C
12
C 100 12.0000
13
C 1.1 13.0033 12.011
H
1
H 100 1.0078
2
H 0.015 2.0140 1.0079
N
14
N 100 14.0031
15
N 0.37 15.0001 14.0067
O
16
O 100 15.9949
17
O 0.04 16.9991
18
O 0.20 17.9992 15.9994
S
32
S 100 31.9721
33
S 0.789 32.9715
34
S 4.44 33.9679 32.066
F

Cl
19
F



35
Cl
100

100
18.9984

34.9688


37
Cl

31.98

36.9659

35.453
Br
79
Br 100 78.9183
81
Br 97.28 80.9163 79.904
analyse de spectres de masse
8
Calcul de masses exactes
Masse moyenne :
(20 * 12.011)
+ (42 * 1.0079)
= 282,55
282
nbre masse masse
A isotopique

moyenne



Hydrogne-1 1 1.0078 1.0079
Hydrogne-2 2 2.0140

Carbone-12 12 12.0000 12.011
Carbone-13 13 13.0034

Soit la molcule
deicosane C
20
H
42
:
Masse exacte M :

(
12
C
20
1
H
42
)
(20 * 12.000)
+ (42 * 1.0078)
= 282,33
Masse exacte M+1
avec un
13
C :
(19 * 12.000)
+ (1 * 13.0034)
+ (42 * 1.0078)
= 283,33
Masse exacte M+1
avec un
2
H :
(20 * 12.000)
+ (41 * 1.0078)
+ (1 * 2.0140)
= 283,33
N.B. Pour le calcul de masse moyenne et exacte : voir fichier excel sur www.ipl.be
La diffrence entre masse exacte M et masse moyenne MM augmente avec la taille de la molcule :
A entre MM et M = 1 Da / 1500 Da
analyse de spectres de masse
9
Calcul de labondance relative des satellites
isotopiques M+1, M+2 pour des petites molcules
Type
dlment Caractristiques Exemple Abondance relative du 2
me
isotope*


1! Isotope ou F -
Q plusieurs isotopes I -
dont un est majoritaire P -
(A > 99,9%) H 0,015

Q+1 Isotope M+1 C 1,08
non ngligeable N
0,37

O 0,2
Q+2 Isotope M+2 S 4,43
non ngligeable Cl
31,98
Br 97,28

* Abondance
de lisotope
majoritaire
= 100

M+1 ~ (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N )

M
M+2 ~ (31,98 . Nombre de Cl) + ( 4,43 . Nombre de S ) +

M
Satellite M+1 :
Satellite M+2 :
100
100
analyse de spectres de masse
10
Exemple 1 : soit leicosane C
20
H
42

Estimation du rapport M+1 / M : 20 x 1,08 % = 21,6 / 100
M
282,3
M+1
283,3
Abondance des satellites isotopiques
Exemple 2 : soit un pic de masse 282 dont M+1 / M = 11%.
Ce pic ne peut correspondre qu une molcule de maximum 10 C
(ou moins de 10 C et dautres lments Q+1 tels que N)

analyse de spectres de masse
11
Massifs isotopiques complexes
Si la molcule contient plusieurs atomes dun mme lment dont le 2me isotope a une
abondance non ngligeable (ex : plusieurs Cl ou plusieurs Br)
Ou si la molcule a une masse leve (> 500 Da) :

La probabilit davoir 2 ou >2 isotopes minoritaires dans une mme molcule devient
non ngligeable. Cette probabilit augmente avec la masse de la molcule.
Prsence de satellites isotopiques M+3, M+4, ..
Le massif isotopique se complexifie*
Exemple 1 : Allure du massif isotopique de molcules contenant 2 Cl, 3 Cl, 4 Cl
* Le dtail des calculs de ces massifs complexes dpasse le cadre de cet expos.

analyse de spectres de masse
12
Exemple 2 : Allure du massif isotopique de molcules contenant un nombre croissant
datomes de carbone.

Si le nombre de C augmente, la probabilit de trouver plusieurs
13
C dans une mme
molcule augmente le nombre de satellites isotopiques augmente
Molcule 50 C : ct du M+1, apparition de satellites M+2, M+3, non ngligeables
Rapport
M / M+1 pour
C 50 H 102
( MM = 703,3 )
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
702 703 704 705 706 707
m/z
a
b
o
n
d
a
n
c
e



Rapport
M / M+1 pour
C 100 H 202
( MM = 1404,7 )
0
1402 1405 1408 1411
m/z
a
b
o
n
d
a
n
c
e



Rapport
M / M+1 pour
C 500 H 1002
( MM = 7015,4 )
0
7008 7015 7022 7029
m/z
a
b
o
n
d
a
n
c
e



Rapport
M / M+1 pour
C 1000 H 2002
( MM = 14 028,8 )
0
14017 14028 14039
m/z
a
b
o
n
d
a
n
c
e



Molcule 1000C : la valeur de masse moyenne (MM) sloigne de celle de M Distribution
gaussienne des satellites - Le plus abondant a une masse proche de la masse moyenne
analyse de spectres de masse
13
Table de massifs isotopiques
Chaque formule brute est associe un massif isotopique qui lui est
propre et dont lallure (masse et abondance des satellites) peut tre
calcule priori.
Programmes de calcul partir dune formule brute : Excel (voir fichier sur
www.ipl.be), Xcalibur, http://www.webelements.com/ , http://www.chemcalc.org/,
analyse de spectres de masse
14
En Conclusion :
Chaque formule brute est associe un massif isotopique qui lui est propre
Pour des molcules de masse < 500 Da :
Labondance des pics M+1 renseigne sur le nombre dlments Q+1 :
M+1/M ~ (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N ) /100
Labondance des pics M+2 et suivants renseigne sur la prsence dlments
Q+2 (S, Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :
M+2/M ~ (31,98 . Nombre de Cl) + ( 4,43 . Nombre de S ) + /100
Un pic M+1 anormalement faible peut tre le signe de la prsence dlments
monoisotopiques (lments Q) : P, I, F
Pour des molcules de masse > 500 Da
Le nombre de satellites isotopiques augmente le massif isotopique se complexifie !
Le pic le plus abondant dun massif isotopique a une masse qui se rapproche de la
masse moyenne. Selon la rsolution, le massif isotopique peut apparatre sous forme
dune bande dont le maximum est la masse moyenne.

1. Ions molculaire et pseudo-molculaire

2. Massifs isotopiques

3. Rsolution

4. Fragmentations et rgle de lazote

5. Ions pseudo-molculaires multichargs et
formation dadduits
Analyse de SM issus du
couplage chromatographie-MS
analyse de spectres de masse
16
Formules brutes* contenant
12
C,
1
H,
14
N et
16
O entre 180.000 et 180.200 :
! Le nombre de formules brutes dont la masse est comprise
entre deux valeurs donnes augmente avec la masse de lentit
Formules brutes*
contenant
12
C,
1
H,
14
N et
16
O
entre 28.000 et 28.200 :
CO : 28.000

N
2
: 28.006
CH
2
N : 28.019*

C
2
H
4
: 28.031
La capacit dun spectromtre distinguer une masse x dune masse y dpend
de la rsolution
* Certaines de ces formules brutes ne correspondent aucune molcule : ex : C
15
ou CH
2
N
analyse de spectres de masse
17
Rsolution = m / Am

Deux pics sont spars si la profondeur de la valle qui
les spare ne dpasse pas une fraction donne de la
hauteur du pic le moins intense (gnralement 10% pour
la haute rsolution et 50% pour la basse rsolution)

Autre dfinition (pour un pic isol) = rsolution FWHM :
Am = largeur mi-hauteur. Dfinition plus flatteuse :
rsolution FWHM / rsolution 10% = 2,2
Si la rsolution est suffisante, on peut alors associer une masse donne une seule
formule brute
Remarque : Un autre paramtre important de lanalyseur est lexactitude en masse cd la
prcision, ou plus exactement la justesse des rapports m/z mesurs. Elle dpend de la stabilit
et du pouvoir de rsolution de lanalyseur.

Am = diffrence de masse correspondant deux pics adjacents tout juste spars
m = masse du premier pic (ou moyenne des masses des deux pics)

Ds lors, un spectromtre dont la rsolution est de 2000 peut sparer des pics situs
des valeurs m/z de 2000 et 2001 (ou de 200 et 200,1 ou de 20,00 et 20,01)

analyse de spectres de masse
18
Basse Rsolution et Haute Rsolution


Formule Brute : Masse exacte M
12
C

1
H
4
16,0313

13
C

1
H
4
17,0346

12
C
257
1
H
383
14
N
65
16
O
77
32
S
6
*

5 803,6377
13
C
12
C
256
1
H
383
14
N
65
16
O
77

32
S
6
*

5 804,6401

14
N
2
28,00615
12
C
2

1
H
4
28,0312

12
C
9
14
N
4
16
O 180,0073

12
C
11
1
H
2
14
N
16
O
2
180,0085

12
C
257
1
H
383
14
N
65
16
O
77
32
S
6
*

5 803,6377
12
C
259
1
H
385
14
N
62
16
O
78

32
S
6
5 803,6390


Am R = m/Am
1,0033 16


1,0033 6 000


0,025 1 100


0,0013 140 000


0,0013 4 500 000

* Insuline
Les spectromtres commerciaux actuels peuvent avoir une rsolution allant jusque 500 000
HR = haute rsolution : R de lordre de 10
4
-10
5
- BR = Basse rsolution : R de lordre de 10
3
Spectromtre
HR ou BR ?
BR


HR



BR


HR


Impossible
sparer
Entits
mais de
masses
trs
proches
Entits
identiques
dont lune
contient un
13
C
analyse de spectres de masse
19
Rsolution : exemple :
Spectre de masse de linsuline :

Masse moyenne : 5807,2222 ; Masse exacte du satellite le plus lger : 5803,6377
Rsolution : 6000 500
analyse de spectres de masse
20
En Conclusion :
La rsolution dtermine la capacit dun spectromtre de masse diffrencier
deux masses : R = m / Am

Pour des molcules de masse < 1000 Da :
Les spectromtres haute rsolution permettent dassocier une masse donne
une formule brute

Pour des molcules de masse > 1000 Da
Ce nest plus le cas. A haute rsolution et selon la taille de la molcule, on peut
parfois distinguer les satellites isotopiques (Am = 1)
Remarque : Les journaux de l American Chemical Society accepte la masse
haute rsolution (R > 200000) comme tant une preuve dexistence du produit
NB : Noubliez pas que lanalyse des massifs isotopiques est une aide prcieuse dans lattribution dune
formule brute

1. Ions molculaire et pseudo-molculaire

2. Massifs isotopiques

3. Rsolution

4. Fragmentations et rgle de lazote

5. Ions pseudo-molculaires multichargs et
formation dadduits
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analyse de spectres de masse
22
Fragmentation
La fragmentation dans la source du pic molculaire (ou pseudo-molculaire)
gnre des pics de masse infrieure M (ou MH
+
)
Source : APCI, Dtecteur : ion-trap
Labondance, le nombre, la distribution des fragments obtenus dans des
conditions danalyse donnes sont caractristiques de la molcule analyse.
MH
+
molcule neutre + cation
m/z =
300.1
Invisible dans
le spectre
m/z =
227.1
Dduction
M = 73
analyse de spectres de masse
23
Analyse des fragments
1./ Il existe des rgles de fragmentation qui permettent didentifier une substance
inconnue partir de ltude de sa fragmentation.
Si on travaille en EI (Impact Electronique), ces rgles reposent sur les principes
suivants :
- Toutes les liaisons nont pas la mme prdisposition se couper;
- Deux facteurs principaux favorisent le processus de fragmentation :
- Les liaisons les plus faibles se coupent plus facilement;
- Les fragments stables ont plus tendance se former

En ionisation chimique, les ions pseudo-molculaires MH
+
donnent seulement quelques
ions fragments et ces ions sont diffrents de ceux obtenus sous impact lectronique.

2./ Il existe des tables
- de compositions possibles dions fragments frquemment observs dans les
spectres
- de compositions possibles de molcules neutres formes lors de la
fragmentation






analyse de spectres de masse
24
Rgle de lazote
Une molcule de masse impaire Nombre impair datomes dazote

Rgle valable pour tous les composs contenant du carbone, de lhydrogne, de
loxygne, de lazote, du soufre, des halognes, du phosphore, du bore, du silicium,
de larsenic et des alcalino-terreux.
Une molcule de masse paire
Nombre pair datomes dazote
(ou aucun atome dazote)

Rem : Lion pseudomolculaire (M+H)
+
correspondant une molcule de masse
impaire protone sera de masse paire et inversment.

1. Ions molculaire et pseudo-molculaire

2. Massifs isotopiques

3. Rsolution

4. Fragmentations et rgle de lazote

5. Ions pseudo-molculaires multichargs et
formation dadduits
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Ion molculaire = radical-cation* provenant de larranchement dun
lectron la molcule neutre : M
+ -
(masse M, charge +1)
Ion molculaire ou pseudo-molculaire
Source
dionisation :

Impact
lectronique (EI)
Ion pseudo-molculaire :
En mode positif : ajout dun proton sur M : (M+H)
+
(masse : M+1, charge+1)
En mode ngatif : perte dun proton : (M-H)
-
(masse : M-1, charge -1)
Ions pseudo-molculaires multichargs :
En mode positif : ajout de z protons sur M : (M+zH)
z+
(masse : M+z, charge +z)
En mode ngatif : perte de z protons sur M : (M-zH)
z-
(masse : M-z, charge z)
! Plusieurs pics pseudo-molculaires dconvolution
La plupart des
sources
(CI, APCI, ..)
Electrospray
(ESI)
analyse de spectres de masse
27
Exemple : spectre ESI du lysozyme
M + 17H
+
= (M + 17)
17+
1049.8 = ( 17 825 + 17 ) / 17

analyse de spectres de masse
28
ESI : Dconvolution dions pseudo-molculaires
multichargs : (M+nH)
n+
ou (M-nH)
n-

0 2000 m/z
Da
m/z = 901
M = 18.000 Da
(M + 20 H)
20+

n = 20
m/z = (M + 20) / 20

ACQUIRED spectrum
DECONVOLUTED spectrum
2
2
2
n
n M
m
+
=
1
1
1
n
n M
m
+
=
2
n
1
n
2 1
1 2
m m
n n
>
>
m/z
[1]
[2]
2 1
1
2
1
m m
m
n

=
1 1
. ) 1 ( n m M =
[1]+[2]
et
n
2
= n
1
+ 1 [3]
+ [3]
analyse de spectres de masse
29
Dconvolution du spectre ESI+ dun mlange de
2 protines : cytochrome C + glucagon
Remarque : la charge courante des protines est au environ de 1 proton / 1000 Da
Glucagon : hormone secrte par le pancras qui exerce un rle dans le mtabolisme des sucres, peptide de 29AA MM 3483
Cytochrome C : protine hmique qui joue un rle dans la chane respiratoire cellulaire
analyse de spectres de masse
30
Dimre, Trimre : 2M + H
+
,


Molcule - Solvant : M + S + H
+


Molcule - Ion :
En mode positif : M + Na
+
, M + K
+
, M + NH
4
+
,


En mode ngatif : M + Cl
-
, M + CH
3
CO
2
-
, .
En ESI+ : (M + nH + mNa)
(m+n)+
,
En ESI- : (M nH + mNa)
(n-m)-
(avec n > m), .


Molcule Ion Solvant : M + S + Na
+
Sources ESI, APCI, ... : Formations dadduits
analyse de spectres de masse
31
Exemple 1 : Spectre ESI+ de la dicentrine : M = 339
d63-3 # 5-27 RT: 0.06-0.40 AV: 23 NL: 2.74E9
F: + c Full ms [ 50.00-1000.00]
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
R
e
l
a
t
i
v
e

A
b
u
n
d
a
n
c
e

702.2
341.5
703.2
309.4
342.5
678.3 717.0 765.8 279.5 362.3 618.1
978.6
420.3 893.6 832.2 935.5 606.0 533.1 251.5 481.8 178.2 127.7 66.3
340
362
[M + H]
+
[M + Na ]
+
679
[2M + H ]
+
701
717 [2M + K]
+
[2M + Na ]
+
N
OCH
3
CH
3
O
CH
3
O
O
analyse de spectres de masse
32
Eau-Aceto-2 #8-10 RT: 0.12-0.16 AV: 3 NL: 1.20E8
T: + c Q1MS [ 50.00-300.00]
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
R
e
l
a
t
i
v
e

A
b
u
n
d
a
n
c
e
220.97
179.98
202.98
162.00
83.13
242.96 278.97
143.96 189.94
72.15 233.80 84.13 126.01 171.04 267.00 212.92 286.92 98.15 117.03 258.93 295.96 60.20
Exemple 2 : Spectre ESI+ de la D-glucosamine :
M = 179
O
CH
2
OH
H
NH
2
H OH
H
HO
H OH
H
180 [M + H]
+
221 [M + CH
3
CN + H]
+
243
Solvant : H
2
O + CH
3
CN (Masse CH
3
CN = 41)
-H
2
O
-H
2
O
[M + CH
3
CN + Na]
+
analyse de spectres de masse
33
Exemple 3 : Analyse HPLC-APCI (mode ngatif)
dun mlange de glucoconjugus
Pas de pic de lion
pseudo-molculaire (M-H)
-
.
La masse molculaire M = 387
est dduite des adduits
35
analyse de spectres de masse
34
Rcapitulatif sur lidentification
dun compos partir dun SM
Formule
dveloppe**
Formule
brute*
MM
Identification du
pic molculaire
(ou apparent)
Identification du
pic molculaire
(ou apparent)
haute
rsolution
Analyse des
satellites
isotopiques
Analyse des
fragments
* Formule brute :
Nombre et nature des
atomes de la molcule

** Formule dveloppe
= structure :
Faon dont les atomes
sont agencs